基因工程《生物技术与生活》《生物技术概论》PPT课件 视图选择纯黑白即可使用.ppt

,现代生命技术的核心,基因工程,DNA重组基因克隆载体目的基因重组DNA导入受体细胞重组子的鉴定基因工程的应用,目,录,基因工程：也称遗传工程，是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生出所需的蛋白质的技术。,特点：打破物种之间的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化手段为人类提供有用的产品及服务。,基因工程研究的理论依据,不同基因具有相同的物质基础。所有生物的DNA组成和基本结构都是一样的。,基因是可切割的。基因直线排列在DNA分子上。除少数基因重叠排列外，大多数存在着间隔序列。可以完整的一个一个地从DNA分子上切割下来。,基因是可以转移的。携带基因的DNA分子可以在不同生物体之间转移，或者在生物体内的染色体DNA上转移，还可以在不同染色体间跳跃，插入到靶DNA分子之中。多肽与基因之间存在对应关系。基因的转移或重组可根据其表达产物多肽的性质来考虑。,遗传密码是通用的。一系列三连密码子同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都相同。,基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。经重组的基因一般来说是能传代的，可获得稳定的转基因生物。,mRNA,DNA,基因工程基本路线生物材料RNA,cDNA文库,基因组文库,人工合成,克隆载体,目的基因受体细胞,重组DNA,克隆子转基因生物,DNA重组在自然界，生物体内时刻发生DNA的重组,导致基因重组，呈现对生物有利或有害的变异。这种重组一般不受人们的意志控制，重组结果难以预测。而基因工程涉及的DNA重组是根据人们的愿望，进行严密设计，在生物体外通过人为的DNA片段化和连接重组，产生新的重组DNA分子，使其遗传信息发生预期的变化。,基因工程,重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。DNA是基因工程操作的主要对象。,所谓基因工程(geneticengineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。,重组DNA技术是基因工程的核心技术,基因工程,DNA的组成和结构脱氧核糖核酸DNA是一类由脱氧核苷酸按照一定的顺序聚合而成的大分子。脱氧核苷酸分子由脱氧核糖、碱基和磷酸基团组成。,脱氧核苷+磷酸脱氧核苷酸,poly,聚合,DNA的化学结构碱基+脱氧戊糖,碱基,戊糖,磷酸,核酸(核苷酸之间通过3,5-磷酸二酯键连接)H,脱氧核苷酸,每一个脱氧核苷酸含有一个戊糖（脱氧核糖）分子、一个磷酸分子和一个含氮的有机碱（碱基）。,脱氧核糖上第1位碳原子与嘌呤或嘧啶结合，就成为脱氧核苷，第3位或第5位碳原子再与磷酸结合，就成为脱氧核糖核苷酸。,脱氧核苷酸的有机碱分为两类；一类是嘌呤，是双环分子；一类是嘧啶，是单环分子。嘌呤包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)2种嘧啶有胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)2种。,DNA的碱基是A、T、G、C。,成为DNA的基本结构。,T,脱氧核糖核酸DNATT多个脱氧核糖核苷酸以磷酸顺序相连成长链的多核苷酸分子，即,DNA双链结构碱基互补配对：A与T配对、G与C配对，通过氢键相连形成双链结构；并且G=C（三条氢键）、A=T（两条氢键）。DNA变性：当温度超过90时，氢键断裂而解链成单链DNA。DNA复性：高温变性的DNA被逐渐冷却时，分开的两条单链又重新结合成双链DNA的过程。书写顺序：以53走向的单链DNA的核苷酸序列来表示。如DNA片段5-GATCATGCATC-33-CTAGTACGTAG-5,可写成,5-GATCATGCATC-3。,几乎所有真核生物的染色体DNA都是线性的，大部分原核生物的染色体DNA、全部线粒体、叶绿体DNA以及细菌质粒DNA是环状的。,DNA分子的结构特征,原核生物DNA分子中有基因重叠现象,真核生物DNA分子中普遍存在非编码顺序(内含子)编码的核苷酸顺序携,带着遗传信息,GENE1ATGCCGAGTCAGACTACGAGENE2,插入顺序,编码区,DNA:ACGTGGCCAGCC,Thr,Trp,ProAla,AA:,DNA一级结构,5-磷酸3-羟基,碱基脱氧核糖,DNA的二级结构(双螺旋),1953年，,Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构。,DNA的功能,基因工程,在细胞内复制方式：半保留复制基本规律需RNA引物、DNA聚合酶和四种dNTP需多种生物大分子参加合成方向：53复制,基因工程,DNA的功能携带遗传信息中心法则,转录遗传信息从DNA传递给,核糖核酸(RNA)的过程。,信使RNA(mRNA),转运RNA(tRNA),核糖体RNA(rRNA),翻译遗传信息通过mRNA进一,步传递给蛋白质的过程。,基因编码一个RNA或一条多,肽链的DNA片段。,启动子转录过程中RNA聚合酶识别和结合的,位点，不转录相应的RNA序列。,基因编码区指转录mRNA上起始密码AUG,至终止密码UAG（UAA、UGA）的各种遗传密码的核苷酸序列。,转录终止子基因编码区下游的一段使转录,终止的核苷酸序列。一般为富GC的反向互补重复序列，由此转录的RNA折叠形成终止子发夹结构。,遗传密码,密码子的概念密码子的性质简并性通用性非重叠性,方向性起始密码兼职性,基因工程,三个相邻核苷为一组密码子,在mRNA分子上三个连续的核苷酸组成一组，代表一个氨基酸，因而又称为三联体密码，也叫氨基酸密码。,第一密码,第三密码,基因工程遗传密码第二密码,基因工程中的工具酶,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成核酸连接酶用于DNA和RNA的连接,核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类用于生物细胞的破壁，转化，核酸,纯化，检测等。,基因工程,限制性内切酶,限制性内切酶一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH基团和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。型酶,型酶型酶,限制性内切酶的命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。,例如：Hind,前三个字母来自于菌种名,称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichiacoliRIHindHaemophilusinfluensaedSacI(II)StreptomycesachromagenesI(),限制性内切酶的特点1.识别顺序和酶切位点）识别-8个相连的核苷酸,HindIIIAAGGTT；BamHIGGATCC：,MaeIIIGTNACDraIIPuGGNCCPy,）富含）对称性旋转对称或互补对称,EcoRI,5-GAATTC-3,3-CTTAAG-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和-,PstI,5-CTGCAG-33-GACGTC-5,5-CTGCA3-G,G-3ACGTC-5,）-端突起，个数为或个核苷酸,EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5,5-GOH3-CTTAAP,PAATTC-3HOG-5,限制性内切酶的特点2.末端种类）-端突起，个数为或个核苷酸,在进行DNA重组时，应用同种限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生互补的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子。,GAATTC,CTTAAG并做如下切割：5NNNNGAATTCNNN33NNNNCTTAAGNNN5,限制性内切酶,5NNNNG,AATTCNNN3,3NNNNCTTAA,GNNN5,EcoRI识别序列：,基因工程,CTGCAG,GACGTC并做如下切割：5NNNNCTGCAGNNN33NNNNGACGTCNNN5,限制性内切酶,5NNNNCTGCA3NNNNG,GNNN3ACGTCNNN5,PstI识别序列：,基因工程,基因工程,限制性内切酶的识别序列EcoRI的识别序列是：5-G-AATTC-33-CTTAA-G-5限制性核酸内切酶EcoRI的作用,同裂酶（isoschizomer）1.定义能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。2.特点1）识别相同顺序2）切割位点异、同,KpnIGGTACCSstICCGCGG,Asp718GGTACCSacICCGCGG,基因工程,基因工程,MunI的识别序列5-CAATTG33-GTTAAC5,EcoRI的识别序列5-GAATTC33-CTTAAG5,同尾酶（isocaudomers）定义来源不同、识别及切割序列也不相同，但却能产生相同的粘性末端的限制酶。两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。EcoRI和MunI同属同尾酶。,一些常用限制酶的识别序列及其产生菌,基因工程,基因工程,限制性内切酶的酶切位点概念酶切位点粘性末端（3粘性末端、5粘性末端）平末端,限制酶切割DNA分子示意图,DNA连接酶的连接作用示意图,在合成重组DNA分子过程中，互补的碱基处虽然连接起来，但是这种连接只相当于把断成两截的梯子中间的氢键（踏板）连接起来，两边的扶手的断口处还没有连接起来，这就要靠另一种极其重要的工具DNA连接酶。,200多种限制性内切酶，切点各不相同。,平整末端,粘性末端,基因工程,基因工程,限制性内切酶反应系统组成酶反应底物（环状或线性的双链DNA分子）反应缓冲液最适反应温度为37。,基因工程,限制性内切酶酶切DNA的方法单酶切法用一种限制性核酸内切酶酶切DNA样品。环状DNA酶切后产生与识别序列数（n）相同的DNA片断，并且两末端相同。线形DNA分子则产生n+1个片段，其中有两个片段仍保留原来的末端。,限制性内切酶酶切DNA的方法,基因工程,双酶切法,用两种不同的限制性核酸内切酶酶切同一种DNA分子的方法。无论是环状的还是线形的DNA酶切结果产生的两个粘性末端不同。,限制性内切酶酶切DNA的方法,基因工程,选用的限制性内切核酸酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的酶切。底物DNA纯度低识别序列甲基化酶用量不足反应时间不够反应缓冲液和温度不适宜,部分酶切原因,PCR扩增技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）即PCR法，是一种在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。PCR技术只需数小时，就可在体外将该特定的基因扩增百万倍，免除了基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。,基因工程,PCR基本原理模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的,以DNA互补链聚合反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。,基因工程,扩,基,因,的,链,式,扩,增,反,应,535,353,变性(94)+,353,P1P1,+P2,5复性(55)3+5P2合成（72）,基因工程,PCR增技术,基因工程,PCR基本过程变性加热至9095，模板DNA经热变性，变为两条单链，作为互补链聚合反应的模板；复性使温度下降至3760，寡核苷酸引物即与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对；延伸升温至7075，引物3-端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。变性、复性和延伸三步骤构成一个循环，新合成的DNA链又可作为模板进行下一个循环的复制。DNA片段以2的指数增长，在12h内重复2530次循环，扩增的DNA片段拷贝数可增至106107倍。,PCR扩增过程,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得230（1.07109)个基因片段,PCR扩增方式,耐热性DNA聚合酶耐热性DNA聚合酶的发现使PCR扩增特异性DNA片段成为可能。由于这种酶在靶DNA变性的高温下仍保持活性，所以在PCR扩增特异性DNA片段的全过程中，只需一次性加入反应系统中，不必在每次高温变性处理后再添加酶。目前用于PCR的耐热性DNA聚合酶主要有：TaqDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、C.themDNA聚合酶。,基因工程,基因工程,PCR引物引物是PCR过程中与模板DNA序列互补，并能引导模板DNA的互补链合成的一种脱氧核苷寡聚体，其端必须具有游离的OH基团。为扩增特异性高的DNA片段，设计并用化学方法合成的引物由2030个核苷酸组成。,基因工程,DNA片段的连接重组DNA连接酶催化双链片段紧靠在一起的3-OH末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接，形成重组DNA分子。T4DNA连接酶:1)相同或互补粘性末端的连接2)平整末端的相连E.coliDNA连接酶:互补粘性末端的连接,基因工程,基因克隆载体克隆载体（cloningvector）：把一个有用的目的DNA片段（基因）通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。作为克隆载体的基本要求：能进行独立自我复制；具有便于外源DNA的插入和限制酶作用的单一切割位点；必须具有可供选择的遗传标记。例如具有对抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选；不含有对受体细胞有害的基因，不会任意转入其它生物的细胞。,基因工程,在基因工程中的载体基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括：质粒载体噬菌体载体复合载体病毒载体人工染色体克隆载体,载体的选择是一个有自我复制能力的复制子（replicon)能在受体细胞内大量增殖，即有较高的复制率。载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。载体上必须有一种选择遗传标记，以便及时将“工程菌”选择出来。,基因工程,基因工程,载体的选择有条件作为载体的，对原核受体细胞来说，主要有细菌质粒（松弛型）和噬菌体两类。对真核微生物受体来说，主要有SV4O病毒。SV4O病毒是猴体内小型环状双链DNA病毒对植物细胞受体来说，主要是Ti质粒。,术语解释,R因子（resistencefactor）：抗性因子。Col因子（colicinogenicfactor）：产大肠杆菌素因子。一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含Col因子的近缘的其它肠道细菌。,F-因子（fertilityfactor）：致育因子/性因子。,基因工程,1.质粒克隆载体质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。经人工修饰改造后作为克隆载体具有十分有利的特性：具有独立复制起点；具有较小的相对分子质量，一般不超过15kb；具有较高拷贝数，使外源DNA得以大量扩增；易于导入细胞；具有便于选择的标记和具有安全性。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA(cccDNA)，开环DNA(ocDNA)，线性DNA(cDNA)，具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。,质粒的一般生物学特性,编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。,质粒的一般生物学特性,质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定的条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。,质粒的一般生物学特性,质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。,质粒的拷贝数与不亲和性,质粒的拷贝数,指某种质粒在一个细菌细胞内的数,目。根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为15个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10200份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。质粒的不亲和性（不相容性）指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。,Amp,基因工程,大肠杆菌质粒载体是应用最广泛的克隆载体，含有大肠杆菌源质粒ColE1复制起始位点（Col-ori），能够在转化的大肠杆菌中按质粒复制的形式进行复制。pBR322是一种常用的典型的质粒载体。HindIIIBamHIPstISalI,ScaI,r,pBR322(4.36kb)ori,Amp,1.分子量较小（4363bp）而拷贝数较大，每个,细胞中可累积10003000个拷贝。,2.具有两种抗菌素抗性基因：apr（氨苄西林,抗性基因）、tcr（四,环素抗性基因），可作为筛选转化子的选择标记基因。,BamHI,SalI,HindIII,PstI,ScaI,r,ori,pBR322(4.36kb),pBR322质粒载体特点,pUC18和pUC19质粒载体,EcoRISacIKpnISmaIBamHIXbaI,SalIPstISphIHindIII,HindIIISphIPstI,pUC18SalIXbaIBamHISmaIKpnISacIEcoRI,Ori,LacZ,(2.68kb),Apr,pUC19MCS,为便于外源DNA,片段的克隆，在载,体合适的位置上组,装一个多克隆位点（MCS）连杆，如质粒载体pUC18、,pUC19。二者的差,别在于MCS上各种,克隆位点的走向相,反，便于用两种内切酶酶切产生的一个DNA片段以正反,两个方向组入载体。,基因工程,蓝藻穿梭质粒载体某些蓝藻含有内源质粒，但不能直接作为载体用于转化蓝藻，必须构建成穿梭载体，即除大肠杆菌质粒载体必备元件外，还必须含有蓝藻质粒的复制起始位点，如p33图2-10。ORI,基因工程,农杆菌Ti质粒载体Ti质粒（tumorinducingplasmid）：诱癌质粒。致癌农杆菌含有一种内源质粒，可引起许多双子叶植物的根癌。Ti质粒是一种双链环状DNA分子，长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,Ti质粒,基因工程,酵母2m质粒载体酵母是一种最简单的单细胞真核生物，几乎所有的酿酒酵母中都存在一种质粒，即2m质粒。一般将酵母2m质粒构建成穿梭质粒载体，含有2m质粒的复制起始位点和大肠杆菌源质粒的复制起始位点。,基因工程,T-克隆和U-克隆载体用于T-A克隆的载体称为T-克隆载体。5端带有一个不配对的碱基T,可将PCR产物以TA配对连接的方式直接克隆。用于U-T克隆的载体称为U-克隆载体。5端带有一个不配对碱基U的线性质粒，可将PCR产物以UT配对连接的方式直接克隆。,T-克隆载体两条链的5端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多,加一个A,T-A克隆,基因工程,DNA,2.病毒（噬菌体）克隆载体把感染细菌的病毒称为噬菌体，由此构件的载体称为噬菌体载体。噬菌体蛋白质,头部,尾部尾丝,噬菌体感染细菌示意图,噬菌体克隆载体,噬菌体优点,其分子遗传学背景十分清楚；,载体容量较大，一般质粒载体只能容纳10kb，而噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段；具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达100%，而质粒DNA的转化率却只有0.1%。,DNA构建克隆载体的依据,DNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，两端各有5凸出粘性末端而且互补，进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子。DNA上约有20kb的区域对噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代。,构建噬菌体载体克隆载体的原则,删除基因组中非必需区，除去多余的限制位点；在非必需区可组入选择性标记基因；构建的DNA载体不应小于36.4kb。,柯斯（Cosmid）质粒载体,柯斯质粒载体（cosmidvector）,即粘粒载体，由噬菌体的粘性末,端和质粒构建而成。柯斯质粒载体,含有来自质粒的一个复制起点、抗,药性标记、一个或多个限制酶单一,位点，以及来自噬菌体粘性末端,的DNA片段，即cos位点，其对于将,DNA包装成噬菌体粒子是必需的。,柯斯质粒载体的优点,具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞,后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在；,具有质粒DNA的复制方式，重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA分子，如同质粒一样进行复制；,具有克隆大片段外源DNA的能力，Cosmid质粒本身一般只有57kb左右，而它可克隆外源DNA片段的极度限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及噬菌体载体的克隆能力。,植物病毒克隆载体,构建构建植物病毒克隆载体的基本策略：对病毒DNA进行加工，消除其对植物的致病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，是携带的目的基因导入植物细胞。,目前应用于植物细胞的克隆载体：由Ti改建的克隆载体；整合平台系统克隆载体，不受植物种类限制；35S启动子表达载体，是一类植物病毒克隆载体，能启动目的基因在植物细胞中进行高效表达。p37：图2-14。,动物病毒克隆载体,质粒克隆载体不能用于动物基因，在动物转基因研究中所用载体为动物病毒克隆载体。,目前用于构建克隆载体动物病毒：痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒、猿猴空泡病毒、反转录病毒。,以痘苗病毒DNA（线形双链）作载体。将外源基因与痘苗病毒基因组的基因或基因同源重组，将外源目的基因整合到痘苗病毒基因组上，包装后的重组痘苗病毒转导敏感的动物。,痘苗病毒载体,特点：表达的产物更接近于天然产物的生物活性和理化性质；外源基因插入量大；宿主细胞广泛；表达产物可直接刺激机体产生体液和细胞免疫，纯化过程简单，产物性质稳定，易于保存运输；所表达的外源目的基因在实验动物中可提供保护性免疫反应。,3.人工染色体克隆载体,基因工程,酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。酵母染色体的控制系统主要包括三部分：着丝粒（centromere,CEN）：它的作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞。端粒（telomere,TEL）：位于染色体两个末端，功能是保护染色体两端，保证染色体的正常复制，防止染色体DNA复制过程中两端序列的丢失。,DNA复制起点（autonomouslyreplicating,sequence,ARS）：其功能与酵母细胞复制有关。抗药基因标记、EcoRI限制位点、BamHI限制位点。,酵母人工染色体和使用示意图,用BamHI及EcoRI双酶切YAC，获得具有BamHI和,EcoRI酶切末端的两个DNA片段。,与两端具EcoRI酶切末端的外源DNA连接，构成酵母,人工染色体。,将目标DNA并入YAC载体的步骤,真核细胞里的某些DNA序列，尤其是重复性序列，很难在细菌内复制。酵母细胞属於真核细胞，较容易复制一般真核细胞的DNA序列。,YAC能携带长达1000kb-3000kb的DNA片段，比质粒或,噬菌体多十倍。用于构建基因文库、基因治疗和基因功能,鉴定。,YAC载体优点,基因工程,目的基因目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。目的基因一般是结构基因，是能转录和翻译出多肽（蛋白质）的基因。,目的基因的来源,取出DNA用限制酶切断DNA,将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。目前被较广泛提取使用的目的,基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,基因工程,获得目的基因的途径,酶切直接分离法构建基因组文库或cDNA文库分离法PCR扩增法化学合成法,基因工程,1.直接分离目的基因鸟枪法将供体生物的DNA用限制酶切割，分离出含目的基因的DNA片段，再用载体将这些片段运载到受体生物的不同细胞,中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。,用限制酶切割,2.PCR直接扩增法,PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因。以目的基因DNA为模板，合成一对互补的引物，可十分有效的扩增出目的基因的DNA片段。p43：图2-19。,成合成DNA(基因)。2.直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。,DNA合成仪PCR扩增仪,3.人工基因合成法1.逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合,4.构建基因组文库筛选目的基因,利用重组DNA技术，可将某种生物染色体基因组的全部遗传信息贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）之中，这种群体即为这种生物的基因组文库。犹如将文献资料贮存于图书库一样，以供长期贮存和随时调取克隆基因使用。,基因组文库(genelibrary),基因文库（genelibrary）,构建流程,抽提基因组DNA,鸟枪法制备DNA片段,DNA片段与载体重组,转化宿主菌,筛选目的基因,基因组文库的构建步骤,1、从组织或细胞提取基因组DNA；,2、用限制性酶部分水解成适当长度的DNA片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片段；3、通常采用噬菌体或柯斯质粒载体等容载量较大的克隆载体，在适当位点将载体切开；4、将基因组DNA片段与载体进行体外连接；5、重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。,基因文库的构建,将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质,粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。,细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。,某种生物基因组转录的全部mRNA经,反转录产生的各种cDNA片断分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库。,cDNA文库,(complementaryDNAlibrary),cDNA文库的构建步骤,从生物体或细胞中提取mRNA；利用逆转录酶以寡聚核苷酸为引物合成cDNA的一条链；利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链；cDNA与载体的体外连接；噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。,从文库中获得目的基因,在构建文库之后就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。通常的鉴定方法是核酸探针法。,探针（probes）：根据所需基因的核苷酸顺序制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记。,基因工程,重组DNA导入受体细胞途径转化法：通过生物学、物理学、化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。如果外源DNA分子是病毒（噬菌体）的DNA，则此过程称为转染。转导法：用病毒（噬菌体）DNA构建的克隆载体或携带目的基因的克隆载体，在体外包装成病毒（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受体细胞的过程。,遗传转化常用的方法,载体法转化农杆菌介导法基因的直接转移,（1）高压电脉冲电激穿孔（2）基因枪法（3）微注射法,基因工程,克隆子的筛选克隆子：摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞。转化子：采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子。重组子：含有重组DNA分子的克隆子。,pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，,lacZ基因便可表达出半乳糖苷,酶，如果平板培养基中含有,IPTG和X-gal，X-gal便会被半,乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。,在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结,构，大肠杆菌形成白色的克隆。,利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒,2.形成噬菌斑筛选转化子,重组子的鉴定,琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：,磷酸基团带负电荷,酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力,不同迁移率,分子量标准参照物,酶切和电泳方法,无菌落,筛选重组子的示意图,Ampr,Tc,AmprTcs,有DNA插入外源DNAAmprTcs阳性菌落提取DNA电泳重组DNA,1)限制酶切2)DNA重组无DNA插入AmprTcr转化AmprTcr筛选重组子AmprTcs,外源DNA,Apr,利用菌落颜色筛选重组子,Apr,无DNA插入,1)限制酶切2)DNA重组有DNA插入AprApr转化Apr筛选重组子白色菌落提取DNA电泳重组DNAApr,32P标记的DNA分子探针杂交,放射自显影法,DNA杂交直接鉴定,纪念发明者EdwardSouthern,（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳,（4）转移到滤膜（5）变性解链,（6）DNA探针及杂交（7）洗脱,（8）放射自显影（9）比较分析,转化子的分析Southern杂交,Southern杂交分析示例,A.DNA体外重组实验,B.抗生素筛选转化子细胞C.培养突变株