实验七 质粒DNA的电泳检测.ppt

基因工程实验课,新乡医学院生命科学实验示范中心,办公电话：3029114,主讲人：王文锋Email：wwf5718,质粒DNA的电泳检测,一、实验目的,1.掌握利用溴化乙锭（EB）在紫外下检测DNA的原理。2.掌握水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的方法、步骤。3.掌握在紫外灯下判断DNA的浓度、分子量大小、纯度等方法。,二、实验原理,根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳,DNA电泳影响因素（1）DNA分子大小DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。（2）DNA分子构型超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。（3）不同的胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。,（4）电场强度电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。（5）电泳缓冲液目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE。（6）溴化乙锭简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间.,DNA电泳上样缓冲液主要作用如下：防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，增加样品的比重。指示剂监测电泳的行进过程。,三、操作步骤,1称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml正好倒两块小胶。2注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。3戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约5060C）。,4把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置1020min待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。5在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。,6待胶完全凝固后（1520min），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。7剪1片光面纸（或封口膜），点6l蒸馏水、1l10加样缓冲液，再加入3l质粒DNA溶液制成10lDNA样品。,8在凝胶上选择相邻的加样孔。用10l的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.53lDNA分子量标准物）。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。,9打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。10当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。,11把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置约10min后，取出用自来冲洗两次。放入凝胶成像系统中拍照。12清理垃圾。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。13撰写实