分子生物学--第一章-绪论

MolecularBiology分子生物学,张腾国,第一章绪论Introduction,分子生物学的基本含义是什么？分子生物学的研究对象是什么，它与生物化学，细胞生物学，以及生物医学的关系如何？分子生物学的研究内容有哪些？分子生物学发展史上有哪些重要事件？,一、分子生物学的基本含义,分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科。,二分子生物学的基本原理：,1.构成生物体的有机大分子的单体在不同生物体内都是相同的；2.生物体内一切有机大分子的构成都遵循共同的规律；3.某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质决定了生物的属性。,三研究对象：,核酸遗传信息的载体，决定生物性状；稳定遗传，保证种的延续，母代子代；易于操作，易于保存，蛋白质蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，它是一切生命活动的执行者。,四分子生物学与其他学科的关系,分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，凝聚了不同学科专长的科学家的共同努力。它虽产生于上述各个学科，但已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。,（1）生物化学与分子生物学关系,生物化学与分子生物学关系最为密切。两者同在我国教委和科委颁布的一个二级学科中，称为“生物化学与分子生物学”，但两者还是有区别的。,生命信息（信号）的传递和调控,分子生物学的相关学科：,1.生物化学生物化学是分子生物学的基础，学好生化便于分子生物学的基本原理和方法的理解。2.微生物学作为分子生物学研究的模型生物,分子生物学操作的一部分（基因扩增、克隆、表达）3.遗传学研究生物的遗传及变异规律，遗传变异的本质DNA4.细胞生物学细胞是生命的基本功能单位，基因功能必须通过细胞来表现，离开细胞，就没有生命。,11,（2）分子生物学与医学的关系,由于分子生物学涉及从分子的水平认识生命的本质，它也就自然广泛的渗透到医学各学科领域中，成为现代医学重要的基础。在医学各个学科中，包括生理学、微生物学、免疫学、病理学、药理学以及临床各学科。分子生物学都正在广泛地形成交叉与渗透，形成了一些交叉学科，如分子免疫学、分子病毒学、分子病理学和分子药理学等，大大促进了医学的发展。,五分子生物学的主要研究内容,1、DNA重组技术基因工程2、基因表达调控核酸生物学3、生物大分子结构功能结构分子生物学4、基因组、功能基因组与生物信息学研究,（1）DNA重组技术（又称基因工程）,基因工程就是将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计与载体定向连接起来，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA的蛋白质。1972年,美国斯坦福大学的P.Berg教授把猴病毒（SV40）DNA和噬菌体DNA片段用限制性内切酶剪切后，经噬菌体T4DNA连接酶连接，在体外建成了杂种病毒的DNA分子，并在猴组织培养细胞中得到繁殖。限制性内切酶和DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。,表达载体包括的元件,PCR定点诱变,NotI,AvrII酶切,NotI,AvrII酶切,重组连接,重组表达载体pPIC9K/3D的构建图,3D基因,图4表达产物的SDS-PAGE电泳分析1Mark(94000、67000、43000、30000、20100)2,3expressionsupernatantofSMD1168/pPIC9K/3D4expressionsupernatantofSMD1168,22,表达产物的SDS-PAGE电泳图阴性对照阳性菌株,24,25,DNA重组技术的应用前景:,用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类以及抗体。美国批准上市的基因工程产品有人类胰岛素，人类生长因子，白介素，干扰素等。DNA重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构，使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百上千倍的地提高。有一种含有分解各种石油成分的重组DNA的超级细菌，能快速分解石油，可用来恢复被石油污染的海域或土壤。进行基础研究。如启动子的研究，转录因子的克隆和分析。,27,人体生长激素释放激素(SS),抑制和调节多种激素的作用,28,基因工程胰岛素（一）,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,胰岛素分子结构,29,基因工程胰岛素（二）,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!,胰岛素生产车间,30,超级动物,导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠,1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”,31,囊性纤维变性是一种遗传病，患者体内会产生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道，大约有一半的患者活不过31岁。英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。维尔莫特所在的研究所曾向德国一家药厂出售一头这样的转基因羊，获得50万英镑。,32,基因工程与环境污染治理,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,转基因动植物和基因剔除动植物的成功是基因工程技术发展的结果。1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核内，培育得到比原小鼠个体大几倍的“巨鼠”，激起了人们创造优良品系家畜的热情。我国水生生物研究所将生长激素基因转入鱼受精卵，得到的转基因鱼的生长显著加快、个体增大；用转基因动物还能获取治疗人类疾病的重要蛋白质，导入了凝血因子基因的转基因绵羊分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子，能有效地用于血友病的治疗。,举例,在转基因植物方面，1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场。（怕冻的蔬菜）1996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产，我国科学家将自己发现的蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株。到1996年全世界已有250万公顷土地种植转基因植物。,（2）基因表达调控研究,蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列。基因表达实质上就是遗传信息的转录（从DNA到RNA）和翻译（从RNA到蛋白质）。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。基因由此而分为两类：管家基因，其表达产物大致以恒定水平始终存在于细胞内，这类基因的表达为组成型表达；可调基因，它们的产物只有在细胞需要时才表达，称为可调型表达或诱导型表达。,36,37,真核生物和原核生物基因表达的对比,38,39,4处理下，CbMAPK3激酶基因的转录水平迅速增长，并在处理0.5小时时达到最高值，然后表达量逐渐降低，处理24h后，降低到了基础水平。4下处理时，CbMAPK3激酶基因的转录水平同样迅速增长，并且在处理24小时时仍然保持在较高的水平。在ABA的处理下，CbMAPK基因的转录在30min内明显升高，并在处理12小时之后逐渐降低。高盐处理下，CbMAPK基因的转录在2-6小时达到一个很高的水平，在12-48小时表达量有所降低，但仍然维持在一个较高的水平。,高山粒子芥悬浮细胞在4处理下，CbMAPK3激酶蛋白质水平在处理前3个小时有所增加，并在3小时时达到最高值，然后逐渐降低，处理24h后，降低到了基础水平。,4处理下CbMAPK3激酶蛋白质水平变化,（3）结构分子生物学,结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必须具备两个前提:首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。主要研究方向：包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。,结构和功能是密切相关的,43,三磷酸甘油醛脱氢酶,44,己糖激酶,（4）基因组、功能基因组与生物信息学,基因组:一个细胞（或生物体）内所有基因的组合基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学（structuralgenomics）和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（functionalgenomics)，又被称为后基因组（postgenome）研究。功能基因组学：研究基因组内每个基因的具体功能及其相互关系,基因的功能研究；(function)生化功能：基因的直接活性及蛋白产物的活性（例如与DNA的结合，信号因子，受体，运输蛋白，酶活性等）生理功能：基因表现出来的性状，与生物个体的生存的关系。生化功能是单个分子（基因）的作用或活性，生理功能是分子群的“集体”行为，是多个基因及环境共同作用的行为。生化功能是生理功能的基础，生理功能是表现，由于生物体基因表达的组织和发育阶段的特异性等，生化功能相同生理功能并不一定相同。,血红蛋白：,生化功能：与O2和CO2结合；,生理功能：将O2从肺组织细胞，将CO2从组织细胞肺；,P53基因：生化功能：DNA结合蛋白，与特异的DNA序列结合；生理功能：调节基因表达，阻止细胞过度增殖，抑制肿瘤发生。,生物信息学Bioinformatics定义：对DNA和蛋白质序列资料中各种类型信息进行识别、存储、分析、解读、模拟和传输。,由数据库、计算机网络、应用软件三大部分组成。,目前，国际上有三大生物信息中心：,美国生物工程信息中心GenBank（/）美国基因组序列数据库GSDB欧洲分子生物学研究所EMBL(TheEuropeanMolecularBiologyLaboratory),可进行DNA分析、RNA分析、多序列比较、同源序列检索、蛋白质结构预测等分析。,六分子生物学发展史：,1869Miescher第一次分离了DNA；(为DNA分子操作奠定了基础)1941Astbury获得了第一张DNAX衍射图谱；（开始了DNA空间结构的研究）1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1961Jacob和Monod提出操纵子学说遗传调节机理；1966M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。,具有光滑外表的S型肺炎链球菌因为带有荚膜多糖而都能使小鼠发病，而具有粗糙外表的R型因为没有荚膜多糖而失去致病力.Avery等人将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病能力。再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌天然无致病力。当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死了。解剖死鼠，发现有大量活的S型（而不是R型）细菌。他们推测，死细菌中的某一成分作为转化源（transformingprinciple）将无致病力的细菌转化成病原细菌。10多年后,实验表明,DNA就是转化原,死细菌的DNA指导了这一可遗传的转化.,1944Avery(阿佛雷)细菌转化实验成功，证实了DNA是遗传物质的载体,1953WatsonCrick提出DNA双螺旋结构模型；为合理解释遗传物质的各种功能，解释生物的遗传和变异，解释自然界千变万化的生命现象奠定了理论基础。,1958Crick提出遗传信息传递的中心法则；,识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键,命名：EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序),识别和切割位点,回文结构46bp,1962Arber(阿尔伯(瑞士人)证明限制性内切酶存在；,限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。已经发现和鉴定了200多种,54,1967Gellert发现DNA连接酶,CbMAPK3基因CDS序列PCR扩增产物,EcoRI,SalI酶切,EcoRI,SalI酶切,T4DNA连接酶连接,1970发现反转录酶,反转录酶,19721973创建了DNA克隆技术，DNA重组实验成功开创了基因工程新纪元；,1972年，美国斯坦福大学的PBerg（保罗伯格）博士领导的研究小组，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，并因此与WGilbert、FSanger分享了1980年度的诺贝尔化学奖。Berg等人使用核酸内切限制酶EcoRI，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体的DNA分别进行酶切消化，然后再用T4DNA连接酶将两种消化片段连接起来，结果获得了包括SV40和DNA的重组的杂交DNA分子。1973年，斯坦福大学的SCohen等人也成功地进行了另外一个体外DNA重组实验。他们将编码有卡那霉素（kanamycin）抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒，和编码有四环素（tetracycline）抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101DNA混合后，加入核酸内切限制酶EcoRI，对DNA进行切割，而后再用T