细胞生物学研究方法

1,Chapter3,细胞生物学研究方法,2,3.1显微镜技术,光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。,肉眼：0.2mm;光镜：0.2m;电镜：0.2nm,3,3.1.1光学显微镜技术,1.普通光学显微镜技术相差显微镜技术微分干涉差显微镜技术5.暗视野显微镜技术5.荧光显微镜技术6.激光扫描共聚焦显微镜技术,4,1.普通光学显微镜（TheLightMicroscope）,1)结构,显微镜的分辨力由哪部分决定？,5,分辨率R=0.61/NANA（数值孔径）=照明光源的波长，白光约为500nm。如40/0.65100/1.4R=0.61/NA=0.61X0.5/1.4=0.2m,2）性能指标,6,3）总放大率：物镜的放大倍数X目镜的放大倍数目镜的放大倍数：10X16X有效放大率：所用物镜数值孔径的500-1000倍.空放大：在有效放大外，属于空放大。微细结构分辨不清。任何显微镜而言，最重要的是其分辨力！而不是它的放大倍数。,7,4)目镜的作用：与显微镜的分辨率无关，它只是把物象第二次放大，使眼睛便于观察。目镜只能将物镜已经分辨的影像进行放大，无法观察到未被物镜分辨的细节。问题：使用40/0.65物镜时，应选配适宜目镜5）应用：经过固定染色后，切片标本的观察。,8,石蜡切片样品制备：1).固定；2).脱水、包埋；3).切片；4).选择性染色；5).观察。,固定剂（甲醛）乙醇脱水-二甲苯-石蜡包埋,9,V,WA,p27TUNEL,10,染色细胞,未染色细胞,光线通过染色的细胞，振幅变低。光线通过未染色的细胞，振幅不变，但相位发生改变。利用光衍射和干涉特性，通过添加物镜后焦面上相板和聚光镜上的环状光栅，使相位差变为振幅差，提高明暗对比。,2.相差显微镜(phasecontrastmicroscope),11,在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annularphaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,12,Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.,13,衍射光的相位比直射光推迟1/4波长明反差（负反差）：将直射光推迟1/4入，使直射光和衍射光，维持同一相位，由于干涉现象，合成光的振幅是二者振幅之和，而背景只有直射光，所以被检物体比背景亮。暗反差（正反差）：将衍射光推迟1/4入，由于直射光和衍射光的干涉作用，合成光的振幅是直射光与衍射光的差，而背景只有直射光，所以背检物体比背景暗。,优点：可对未经染色的标本和活细胞进行显微内部结构的观察，提高分辨率,14,3.微分干涉差显微镜（differential-interferencemicroscopy）,利用的是偏振光，这些光经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后在经过另一棱镜将这两束光汇合，从样品中厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，增加了样品反差并且具有很强的立体感。一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作，影像具有浮雕感。,15,丁达尔效应原理分辨力：0.004um利用特殊聚光器，使照明光线不能进入物镜，经过标本的散射光进入物镜放大。观察样品结构的明亮轮廓，如活细胞内的细胞核、线粒体等，但分辨不清内部结构。,4.暗视野显微镜(darkfieldmicroscope),16,(A)普通光学显微镜(B)相差显微镜(C)微分干涉差显微镜(D)暗视野显微技术.,17,5.倒置显微镜,18,倒置：物镜在载物台之下，照明系统在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜。,19,6.荧光显微镜(fluorescencemicroscope),原理：荧光物质经波长较短的光线照射后分子被激活，吸收能量后处于激发态释放能量，其能量一部分转化为热能，大部分能量则以波长较长的光能荧光形式辐射出来。应用：检测细胞上的特异荧光染料。,20,第一滤光片,第二滤光片,平面反射镜,物镜,仪器：光源，滤色装置,高压汞灯,21,22,应用：定性、定位研究,荧光标记物：异硫氰酸荧光素(FITC),rhodamine.,23,多种荧光探针着丝点:红色DNA：蓝色纺锤体微管：绿色,DAPI即4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole),24,25,7.激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope),26,原理,原理,激光光源通过一个微小缝隙，打到一个二向色镜。由镜子反射的光线通过物镜、聚焦在样品的一个层面上。样品被激发后发出较长波长的光，通过物镜成像、聚焦在显微镜中的一个针孔缝隙中，而来自其它层面的光线被挡板挡住。图像通过信号放大传输到计算机中。,27,特点：单色激光形成的点光源光点扫描二维图像改变焦平面三维重建处理优点：使图像异常清晰，提高灵敏度和分辨率,28,肠胚期果蝇胚胎细胞微丝的常规和confocal荧光显微镜的图像比较,29,3.1.2电子显微镜(electronmicroscope),透射电镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）扫描电镜（scanningelectronmicroscope，SEM）,30,原理：电子束:波长比光线的波长短得多。=(150/v)1/2电磁透镜:在电镜中造成磁场的精密线圈，由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间起到透镜作用分辨率：0.2nm，生物样品：1nm,31,原理：电子束:波长比光线的波长短得多。=(150/v)1/2电磁透镜:在电镜中造成磁场的精密线圈，由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间起到透镜作用分辨率：0.2nm，生物样品：1nm,32,原理：电子束:波长比光线的波长短得多。电磁透镜:在电镜中造成磁场的精密线圈，由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间起到透镜作用分辨率：0.2nm，生物样品：1nm,33,各种光及电子束的波长,34,1.透射电子显微镜,1）结构,35,1).光源,电子枪2).非真空，真空3).玻璃，电磁透镜,投影镜,荧光屏或感光胶片成像,直接观察物像,聚光镜,物镜,目镜,36,3）样品制备：固定：戊二醛和四氧化锇乙醇、丙酮系列脱水环氧树脂包埋超薄切片：4050nm电子染色：醋酸铀、柠檬醋铅增加反差,37,38,39,2.冷冻蚀刻技术（freeze-etching）,电镜观察的样品不能太厚，当样品太厚时电子不能穿透，就需要把样品本身去掉，此技术是便于透射电子显微镜观察的一种技术。亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。,40,冷冻-断裂-蚀刻-复型-融化组织,将标本于-100干冰中或-196液氮中，超低温冰冻。然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构蚀刻(etching)。,技术过程,41,剩复型膜观察,45喷铂金,垂直喷碳加固,融组织,冰升华,立体感强，分辨率高，主要用于生物膜结构的研究。,复型膜：样品用重金属倾斜投影后再用碳垂直喷镀一次，以形成一层连续的碳膜，然后以强力的消化剂将生物样品腐蚀掉。这样就只剩下一层可在透射电镜下观察的带有重金属造成的影像的碳膜，称为复型膜。,42,P:protoplasmicfaceE:exoplasmicface,原生质面,外质面,43,冷冻蚀刻复型技术制备的细胞断面,44,3.扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope),45,透镜：汇聚,电子束偏转器扫描发生器,透镜,在观察屏成像,检测器,：,1）原理：电子探针受扫描发生器控制，在样品表面逐点逐线地扫描，样品被电子轰击所产生的二次电子信号被收集、转换、放大，在荧光屏上同步扫描成像。样品发射电子多的地方，在荧光屏上相应的点就亮，反之则暗。,加热的灯丝(电子发射源),46,2）样品制备：固定：戊二醛和四氧化锇乙醇、丙酮系列脱水CO2临界点干燥法：防止样品脱水干燥中表面张力造成的变形,喷镀：为了改善二次电子发放的性质及防止电荷积累（金或铂）,47,蛙内耳毛细胞扫描电镜投影图,3）特点及应用：成像具强烈的立体感，适于观察精细的立体表面结构。分辨率较低（3nm），不能观察内部结构。,48,4.扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope,STM),扫描探针（金属针尖）对样品表面进行扫描。针尖和样品之间会产生隧道电流。针尖和样品间距离的微小变化转换为隧道电流的变化。,49,将探针接近被测样品，并在其间加2-10伏的小电压，当两者距离十分小时（约1纳米），电子就可因量子隧道效应在没有接触的针尖和样品间流动，即产生了隧穿电流。保持两者的距离不变，隧穿电流也保持不变。隧穿电流对针尖和样品间距离的微小变化异常敏感如针尖在样品表面扫描时改变1个原子大小的间距，隧穿电流即可变化1000倍,50,51,优点：高分辨率。具有原子级的空间分辨率。横向空间分辨率为0.1nm，纵向为0.001nm。不需任何透镜，体积小。缺点：是其检查的对象必须是导电体，而生物样品的导电性很差，这是限制其在生命科学研究中应用的主要因素。,52,5.原子力显微镜(AtomicForceMicroscopy),不再要求样品是导电体用于检查不导电的样品的形貌并能得到清楚的图像。但分辨率比扫描隧道显微镜要低，比扫描电镜高。,53,当探针尖端与样品表面接触时，依其作用力作用(吸力或斥力)，使得悬臂弯曲，依据角度的变化，造成二极体电流改变。由测量电流的变化可得知悬臂弯曲程度，输入电脑产生样品表面三维影像。不论绝缘体、半导体、导体都一样可以获得三维空间影像。,54,原子力显微镜肺癌A549细胞,55,1.离心技术(Centrifugation),原理：利用细胞内各种成分的大小、形状和密度不同，采用不同的离心力将之分离。分类：差速离心、密度梯度离心,2.2细胞组分的分析方法,56,1).差速离心（differentialcentrifugation）,原理：主要根据被分离物质的大小差异。体积大的沉降得快，反之沉降得慢。,用途：分离体积相差悬殊的细胞和细胞器。,57,差速离心,-介质密度均一，递增速度逐级离心,58,差速离心I,组织匀浆,沉淀含：细胞核,59,差速离心II,沉淀含：线粒体、溶酶体、过氧化物酶体,60,差速离心III,沉淀含：微粒体小泡,61,微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构包含内质网膜和核糖体两种基本成分。,62,差速离心IV,将上清超速离心150,000g3小时,沉淀含：核糖体,病毒大分子,63,2)密度梯度离心,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：,能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；PH中性或易调为中性；浓度大时渗透压不大；对细胞无毒。,速度沉降离心,特点：常用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度的介质，将待分离的样品加在离心管的最上层。在离心过程中，体积、密度不同的颗粒就会以不同的沉降带分开，最后收集各区带。用途：分离体积大小稍微不同、密度相近的颗粒。,65,特点：在密度连续梯度的介质中，将细胞匀浆置于介质的顶部，离心使匀浆中的不同组分沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡。各沉降带可分别收集。用途：分离密度不同的颗粒常用介质：蔗糖(5%20%)、CsCI,等密度离心（density-gradientequilibriumcentrifugation）,66,速度沉降离心,等密度离心,样品,蔗糖的稳定梯度,慢速沉降成分快速沉降成分,样品,蔗糖的不连续梯度,低浮力密度成分高浮力密度成分,68,优点：可以对细胞内的各种细胞器的化学组成进行直接的定量分析。缺点：1.分离细胞器时难免混入少量其他的细胞器。2.某种细胞器的表面可能吸附了其他细胞器中某种化学物质。,69,2.细胞内大分子成分的显示方法,通过一些显色剂与某些特殊基团特异性结合的性质，利用细胞化学反应来显示细胞内某组分的分布及强弱的技术。核酸、糖类、脂类、蛋白质,70,Feulgen染色的洋葱根尖细胞,Feulgen染色:鉴定DNA紫红色,71,甲基绿-派洛宁染色蛙红血细胞,甲基绿-派洛宁染色：DNA显示绿色与RNA显示红色。,72,PAS染色（过碘酸雪夫染色）,细胞含糖原区呈紫红色,PAS染色法（PeriodicAcid-Schiffstain）：过碘酸雪夫染色-鉴定多糖呈现紫红色,73,细胞内脂类显示橘黄色,苏丹III（三号苏丹红）：脂类显示橘黄色,74,考马斯亮蓝染色显示细胞骨架,75,3.特异蛋白抗原的定位与定性方法,是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位定性测定的技术。a.免疫荧光技术：b.免疫电镜技术：（immunoelectronmicroscopy，IEM）胶体金技术c.蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot),76,抗体Y字形下面的主干部分称为恒定区(Fc)，所有人的抗体的Fc都是一样的，所有鼠的抗体Fc也都是一样，所有山羊的Fc也都是一样。ProteinA识别抗体的FC段。,77,金黄色葡萄球菌蛋白A（proteinA）能与数种哺乳动物IgG分子的Fc段结合。,（1）胶体金技术,78,Immunogoldelectronmicroscopy.Electronmicrographsofaninsulin-secretingcellinwhichtheinsulinmoleculeshavebeenlabeledwithanti-insulinantibodiesboundtotinycolloidalgoldspheres.Mostoftheinsulinisstoredinthedensecoresofsecretoryvesicles;inaddition,somecoresarebeingdegradedinlysosomes.,79,Figure3-41.Thedetergentsodiumdodecylsulfate(SDS)andthereducingagentbeta-mercaptoethanol.ThesetwochemicalsareusedtosolubilizeproteinsforSDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis.TheSDSisshownhereinitsionizedform.,SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis,（2）western技术,80,81,Figure3-42.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS-PAGE).,Electrophoresis,82,83,PVDF膜表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。电转后的NC或PVDF膜上，有很多空白区，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异的信号。封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，以避免一抗的非特异结合，所以起“封闭”的作用。这样抗体就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。,封闭原理,84,底物化学发光ECL,反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，可显影出条带。辣根过氧化物酶在催化过氧化氢的情况下，鲁米诺底物被氧化而产生的发光反应,4放射自显影,原理：利用放射性同位素所发射出来的带电离子（或粒子等）作用于卤化银乳胶（如X光片)，乳胶颗粒曝光形成潜影，通过显影液显示。半衰期：原子不断衰变，当衰变掉一半时所需要的时间32P(14天)、131I(8.1天)、35S(87天)、3H(12.3年)、45Ca(164天)和14C（5590年）等。步骤：测定放射性前体物质渗入细胞后，不同时间所在的位置和化学变化。,86,放射性同位素示踪,用3H标记亮氨酸,10分钟后，在高尔基体中出现,45分钟后，在分泌泡中出现,87,5.定量细胞分析技术-流式细胞术(FlowCytometry,FCM),88,染色,89,Figure3-31.Afluorescence-activatedcellsorter.Whenacellpassesthroughthelaserbeam,itismonitoredforfluorescence.Dropletscontainingsinglecellsaregivenanegativeorpositivecharge,dependingonwhetherthecellisfluorescentornot.Thed