抗生素类药物的分析.ppt

第十一章,抗生素类药物的分析,张蕾,第一节概述,1、抗生素的定义,抗生素是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。,一、抗生素药物的特点,2、抗生素的来源:,生物合成(发酵)化学合成或者半合成,3、抗生素的特点,（1）化学纯度低：,（2）稳定性差：活性组分易发生变化,同系物多，异构体多，降解产物多,抗生素质量的复杂性,二、抗生素药物的质量分析,（一）鉴别试验,（二）抗生素类药物常规检查项目：,用化学法、物理化学法以及生物学法来确认是哪种抗生素,1、稳定性指标：结晶性、酸碱度、水分或干燥失重等,3、安全性指标：异常毒性、热原或细菌内毒素、降压物质、无菌试验,2、控制有机和无机杂质的指标：溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等。,（三）效价测定：有效成分的含量测定,理化方法,生物学法,1、生物学测定法：以抗生素抑制细菌生长能力或杀菌能力作为衡量效价标准。,稀释法,比浊法,管碟琼脂扩散法,国际通用法,既适用较纯精制品,也适用于纯度较差产品已知或新发现抗生素都能应用同一类型的抗生素,不需分离,可一次测定它们的总效价。,原理恰好与临床要求一致，更能够确定抗生素效价。灵敏度高，需要样品量较小,优点：,缺点：,操作步骤多，测定时间较长误差较大,2、物理化学测定法：根据抗生素化学结构利用其理化性质测定主药的含量。,优点：操作简单、省时、方法准确具有较高的专属性,不一定代表生物效价,缺点：,内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类,三、分类（按结构与性质）：,第二节内酰胺类抗生素,青霉素类,（6-AminopenicillanicAcid,6-APA),（一）结构和性质：,头孢菌素类,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,（青霉素G、苄青霉素）,（6-AminopenicillanicAcid,6-APA),代表药物：,氨苄西林（氨苄青霉素）,（6-AminopenicillanicAcid,6-APA),代表药物：,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,（6-AminopenicillanicAcid,6-APA),代表药物：,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,头孢氨苄,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,头孢拉定,头孢羟氨苄,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,头孢噻吩钠,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,酸性,性质:,与碱金属(Na+、K+)成盐,1、羧基:,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,（6-AminopenicillanicAcid,6-APA),与有机碱(普鲁卡因)成盐,普鲁卡因青霉素,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,（6-AminopenicillanicAcid,6-APA),性质:,2、手性C:,头孢菌素类:*C6*C7,青霉素类：*C3*C5*C6,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,（6-AminopenicillanicAcid,6-APA),性质:,头孢菌素类：,青霉素类：,3、共轭体系,母核无明显UV多数有苯环取代基,母核有共轭体系,7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA,（6-AminopenicillanicAcid,6-APA),不稳定,四元环张力大,酰胺键易水解,性质:,4、内酰胺环,（一）K+、Na+反应,二、鉴别试验,（二）呈色反应,1.羟肟酸铁反应,-内酰胺类,红色络合物,（红、棕、褐）,2、硫酸及硫酸-甲醛反应硫酸-变色酸反应硫酸-硝酸反应,（二）呈色反应,1.羟肟酸铁反应,-内酰胺类,红色络合物,3.茚三酮反应,-氨基,蓝紫色,-氨基、伯胺某些羟基胺类,酮式,烯醇式,茚三酮,茚三酮,缩合,蓝紫色,4.双缩脲反应,-内酰胺类,（开环分解）,似肽键,蓝紫色,5.与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素阿莫西林氨苄西林,6.与重氮苯磺酸反应,（偶合）,酚羟基,头孢哌酮,（三）沉淀反应,1.遇酸,在过量HCl或有机溶剂中溶解,2.有机胺盐反应,重氮化-偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,样品、分解产物,Cu2+,头孢氨苄max=262nm,青霉素V钠A280nm/A264nm=1.301.50,-内酰胺环,酰胺,对照品对照法,三、含量测定,（水解）,（一）碘量法,1.原理,水解产物,定量过量,剩余,-内酰胺类,ChP,第一步,第二步,理论上:1mol青霉素8molI原子;实际上:1mol青霉素89molI原子温度，放置时间，pH，浓度，碘过量程度，杂质多少等影响因素。,（1）主试验：,2.方法,（2）空白试验：,I2液（定过量）,I2液（定过量）,例,注射用普鲁卡因青霉素含量测定,取装量差异项下的内容物，精密称取约0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟，再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，摇匀，在2025暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；,另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。,V样空,V样,V对空,V对,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定法一致,3.条件,（1）弱酸性：pH4.5,（2）温度：2426,温度38未水解的供试品亦消耗碘,（3）水解时间：,以水解20分钟后的耗碘量最大。,4.特点,（1）灵敏度高,样品:碘=1:8,（2）反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,10100g/ml,5、计算,（二）汞量法,1.原理,（水解）,青霉素族,ChP,2.方法,样品,以未经水解的样品作空白测定,例,青霉素钠含量测定,取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法(附录A),用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在3540，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定，（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于7.128mg的总青霉素(按C16H17N2NaO4S计算)。,另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上.,每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S计算）。总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。,3.讨论,（1）以第二次滴定突跃为终点电位法指示终点,（2）反应摩尔比1:1,（3）空白试验消除已降解产物干扰,（4）优点不需标准品,4.计算,精密称取含水量为0.5%的青霉素钠0.0502g，按药典方法测定总青霉素含量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密称取上述样品0.5013g，按药典方法测定降解物含量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干燥品计算，求样品中青霉素的含量。,例,青霉素钠含量测定,(0.02moL/L),MissZhang，Pleasehelpme!,1.硫醇汞盐法,（1）原理,（咪唑）,青霉素族,ChP,（三）可见-紫外分光光度法,（2）方法,对照品法,（3）计算,pH9,例,氨苄西林钠含量测定,取本品约60mg置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml，置25ml量瓶中，加硼酸缓冲液2.5ml与醋酐的乙腈溶液（150）0.25ml，放置5min后，加咪唑溶液至刻度，摇匀，置60水浴中，加热30min，取出冷却，照分光光度法（附录A），在325nm的波长处测定吸收度；另取氨苄西林三水合物标准品，按同法测定，计算，即得。,（3）讨论,a.咪唑催化的水解产率高，硫醇汞盐稳定（3h）,b.侧链有-NH2时，需加醋酐先将其乙酰化后才能发生上述反应,（4）特点,A、简便快速B、用标准品对照，重现性良好，RSD1%,（水解）,2.酸水解-铜盐法,（1）原理,稳定剂,JP,青霉素族,3.羟肟酸比色法,USPJP,-内酰胺类,NaOH,第三节氨基糖苷类抗生素,链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素,+N-甲基-L-葡萄糖胺,糖,链霉双糖胺,一、化学结构及性质,链霉胍,+链霉糖,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=HR1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3,一、结构与性质,多与硫酸成盐,（二）溶解性,（四）稳定性,（五）链霉素水解产物反应,二、鉴别试验,（一）共同反应,羟基胺结构,N-甲基葡萄糖胺反应,2、,吡咯衍生物,红色,水解产物N-甲基葡萄糖胺特有反应,红色,1、麦芽酚反应,链霉糖特有反应,（二）链霉素的特征反应,链霉胍特有反应,8-羟基喹啉,2、坂口反应,-萘酚,红色,三、杂质检查,（一）链霉素杂质检查,链霉素B（甘露糖链霉素）,方法TLC中的对照品法（BP）,1.来源反应中间体,发酵菌种不同工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量,ChPUSPBPJP,max=330nm,衍生化原理,1.,1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物,RPHPLC,方法：,规定C12550%C1a1540%C2a+C22050%,计算：,峰面积归一化法,（柱前衍生化）,max=330nm,第四节四环素类抗生素,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,四环素（TC）tetracycline,金霉素(CTC)chlortetracycline,氯四环素,土霉素(OTC)oxytetracycline,氧四环素,多西环素(DOTC)doxycycline,脱氧土霉素,美他环素（METC）metacycline,一、结构与性质,（一）两性,pH4.57.2难溶于水,pH低于4或高于8时,可以得到高浓度的水溶液.,多含结晶水,pH37.5荧光,1.差向异构化,淡黄黑,蓝色荧光,差向四环素,（土霉素、多西环素不易差向异构化）,（1）酸性下降解,max=445nm,max=435nm,橙黄色,脱水四环素,TC,ETC,ATC,EATC,（2）碱性下降解,（荧光）,对各种氧化剂都不稳定，且碱性水溶液特别易氧化，颜色很快变深形成色素，干燥品较稳定，但贮存时遇光可使颜色变深（因空气氧化）。,3对氧化剂不稳定：,正相分配薄层色谱,EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象,（三）荧光反应：,四环素类在紫外灯下产生荧光，其降解产物也具有荧光，可供鉴别。,三、检查,4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）,（一）有关物质,TLC法（1995版）,HPLC法（2000版）,标准品对照法,盐酸四环素,四环素