毛细管电泳05318ppt课件

.,第20章毛细管电泳法(CapillaryElectrophoresisCE),概述20.1CE的基本原理20.2CE的分离模式20.3毛细管电泳仪20.4CE在医药中的应用进展,.,概述,电泳：溶液中的带电粒子（离子、胶粒或分子）在电场中的定向迁移现象。物理化学现象。,毛细管电泳（又称高效毛细管电泳）（HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型电泳分离技术。包含电泳、色谱及其交叉内容。,电泳法（electrophoresis）以电泳为基础的分离分析方法。,.,电泳法的发展史(Phylogeny)：电泳现象早在18世纪就被发现。1909年，L.Michaelis提出“电泳(electrophoresis)”这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的等电点。1937年，瑞典科学家A.Tiselius成功研制出界面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的分离。Tiselius于48年获诺贝尔化学奖。,.,花絮1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；,1.经典电泳技术,利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。,经典电泳法,自由界面电泳（无载体电泳）区带电泳（有载体支持电泳）,.,界面电泳：在没有惰性支持物的液体接界面上进行的电泳。,缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难,.,区带电泳：是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动的电泳方法。避免对流的干扰。,纸电泳醋酸纤维素电泳淀粉凝胶电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,.,常压电泳：电位梯度50V/cm高压电泳：电位梯度50V/cm,影响因素：电荷效应溶液pH值离子强度和温度电渗载体性质和分子筛,电泳速度,电场强度V/L(V/m),电泳速率,.,传统电泳的缺陷：（1）焦耳热效应：电流通过电泳介质而产生的热效应。使电泳分离介质温度分布不均匀，引起溶液对流，从而导致区带展宽，降低分离效率。焦耳热效应随电场强度的增大而迅速加剧，限制了高电压的使用。（2）无法在线检测，定量精度较差。,.,2.高效毛细管电泳技术,1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径的石英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高达40万/m，使电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。,毛细管电泳：使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，使焦耳热效应减小，能使用高电压，全面改善分离质量和提高分析速度。,.,总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点有四个：高效、快速、微量和自动化。,毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，可以使用很高的电压。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内径变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进：一、采用了50m内径的毛细管；二、采用了高达数千伏的高电压；三、实现了高灵敏度的在线检测。,.,1981年，Jorgenson和Lukacs使用75m内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽，成为高效毛细管电泳划时代的里程碑。至此，出现了毛细管电泳技术。80年代以来，诞生了很多新的毛细管电泳方法，如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。88年商品化HPCE问世，高灵敏度柱上检测器的发展使HPCE在世界范围内蓬勃开展。HPCE已成为电泳领域发展最快的新分支。,毛细管电泳的发展,.,高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较,（1）分离过程：相同HPCE与HPLC都是一种液相分离分析技术。都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述,如保留值、塔板理论和速率理论等。（2）分离原理：不同（驱动力不同）HPCE：带电粒子在电场中发生定向移动，依据粒子所带电荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。HPLC：不同组分在两相中的分配系数不同而分离。,.,（4）应用：二者相互补充HPCE在生物大分子分离方面，在分析速度和效率、样品和试剂用量方面有优势，但在样品制备和定性、定量重复性等方面不及HPLC。,（3）仪器流程：基本相同都包括进样装置、分离柱、检测器和数据记录处理等部分。,.,1.分离模式多：2.分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数；3.操作方便、消耗少进样量极少（纳升），水介质中进行；4.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶5.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；,小结：高效毛细管电泳法的特点（多、快、好、省）,.,20.1毛细管电泳的基本原理,一、电泳和电泳淌度二、电渗和电渗率三、表观淌度四、分离效率和谱带展宽五、分离度,.,介质的介电常数介质的粘度i粒子的Zeta电势,近似正比于Z/M2/3Z为净电荷，M为摩尔质量。,电泳的速度uep可表示为：,ep电泳淌度，单位电场下的电泳速度。,空心毛细管柱中一个粒子的淌度近似表示为：,一、电泳和电泳淌度,与介质性质有关,与粒子性质有关：表面电荷和粒子质量的大小,.,有效淌度：在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的淌度称为有效淌度。,i样品分子的第i级电离度i活度系数或其它平衡离解度,总之，粒子的迁移速度除与电场强度和介质的特性有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。不同的带电粒子电泳速度不同，可以实现分离,.,二、电渗和电渗率,电渗（electroosmotic）：在电场作用下，液体相对带电的固体支持介质移动的现象，又称电渗（流）EOF。,.,石英毛细管表面含有许多硅醇基（SiOH），在一定的条件下可离解使表面带有负电荷。,毛细管中的电渗流的形成,双电层,抗衡离子,.,机理：当在毛细管两端加有电场时，双电层内靠近管壁的稠密层中可迁移阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此，带动管中的液体也随迁移着一起匀速向阴极移动，形成电渗流。总之，毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动。,电渗流的特点：具有一定流型，其电渗驱动力沿毛细管均匀分布，所以电渗速度的径向分布几乎是均匀的。,.,eo电渗率，单位电场下的电渗流的线速度,介质的介电常数介质的粘度管壁的Zeta电势，即双电层到管壁很近的地方之间的电位差。,总之，Zeta电势越大，介电常数越大，粘度越小，电渗流越大。在电场作用下，电泳和电渗同时存在，电渗流速度是电泳的57倍。,电渗的速度可以表示为：,.,硅醇基阴离子,石英毛细管柱内壁的双电层结构图,双电层电势,表面电势0,Stern电势d,电动电势,双电层模型,.,电渗流的控制：电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分离，有必要对它进行控制。电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进行调节。（1）电场强度（2）缓冲溶液的pH（影响管壁带电情况）（3）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响Zeta电势）,.,三、表观淌度,在毛细管电泳中同时存在电泳流和电渗流，所以带电粒子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表示为：,uap表观迁移速度ap表观淌度,注：一般情况下，uosuef,.,中性分子,阳离子,阴离子,电渗流,.,四、分离效率和谱带展宽,1.柱效参数理论塔板数和塔板高度,理论塔板数：,塔板高度：,Ld进样口到检测器之间的距离,tm迁移时间，W1/2时间半峰宽,.,影响柱效的因素：（1）n与E成正比，E越大，柱效越高。（2）n与溶质的扩散系数（D）成反比，D越小的分子柱效越高。,毛细管电泳的速率方程：,理论塔板数：,溶质的扩散系数,只有纵向扩散项,.,2.引起带展宽的因素,电渗的流型：呈塞状扁平流型,扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因之一，是理想状态。,.,（1）扩散,扩散系数由溶质本身的性质决定，随分子量的增加而降低。分子越大，D越小。因此，毛细管电泳特别适合分离生物大分子。另外，凡是能影响溶质扩散的因素都会影响谱带宽度。,.,（2）自热（焦耳热）焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，在毛细管内形成径向温度梯度（管壁温度管轴心温度）,表：毛细管壁温度和中心到壁的温差,径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度，引起电泳淌度改变，导致离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，柱效降低。,.,焦耳热和温度梯度的控制焦耳热的大小与毛细管尺寸、缓冲液电导及电场强度有关。操作电压：电压越高，焦耳热越严重。柱内径：是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小的柱内径。缓冲溶液的浓度：浓度增加，焦耳热增加。,.,目前常采用内径为2575m的毛细管柱采用外管壁涂层技术。,Knox方程：Edc1/31500E电场强度，d管内径，c介质浓度,满足上式方程，自热影响较小。当E=50kV/m,c=0.01mol/L时，d140m即能满足上述方程。,.,(3)吸附毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被分离物质粒子的作用。主要原因：阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。内径越细，吸附越严重。,.,五、分离度,分离度：将淌度相近的组分分开的能力。,n理论塔板数u/u两组分的相对迁移速度差,定义式：,根据Gidding方程，分辨率R定义为：,.,对上面的公式处理，可得：,由公式可见：R并非随操作电压线性增加，而是与操作电压的平方根成正比。操作电压的增加受到焦耳热的限制。,.,20.2毛细管电泳的分离模式,一、毛细管电泳的分类二、毛细管区带电泳法三、胶束电动毛细管色谱四、凝胶毛细管电泳法五、毛细管电色谱法,.,一、毛细管电泳的分类,按分离模式可分为三大类,电泳型,毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦电泳,色谱型,毛细管电色谱,胶束电动毛细管色谱微乳液电动毛细管色谱,电泳/色谱型,.,二、毛细管区带电泳法（CapillaryZoneElectrophorsis,CZE）,毛细管区带电泳（又称毛细管自由溶液区带电泳法）是毛细管电泳中最简单、最基本、使用最广泛的一种技术。CZE的理论是其它CE方法的理论模板。,.,中性分子,阳离子,阴离子,1.分离机理在只填充缓冲溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下因淌度不同而进行分离。,.,在毛细管中，由于电渗流的存在，所有溶质都随电渗流一起向负极迁移。在CZE中可以实现正负离子（或粒子）的同时分离,中性粒子随电渗流一起流出毛细管,不能分离（图谱上是一个峰）。组分的检出顺序为：阳离子（粒子）中性粒子负离子（粒子）,CZE溶质的迁移规律小结：,.,2.影响CZE迁移速率的因素（操作条件的选择）（1）操作电压操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度（离子强度）有关。柱长一定时，在一定电压范围内，操作电压与粒子的迁移速度呈线性关系。当电压过高时，线性关系偏移，主要是由高电压引起的焦耳热造成的。电压的极值范围随系统和组成而异。一般为小于30KV。电压对柱效的影响也是相同的。,.,（2）缓冲溶液的选择：重要的分离因素,CZE缓冲溶液必须符合以下条件：在规定的pH值范围内应有较强的缓冲能量，并维持恒定的pH值。尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。在检测波长处有较低的吸收度尽可能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都小。,.,缓冲溶液的pH：是影响组分离子淌度的最主要因素。影响管壁电荷多少，影响电渗流的大小和迁移速率Zeta电位，当pH值在47时，对EOF影响最大影响被分离物质的电荷，影响迁移速度和方向。电离程度：如蛋白质，多肽等，荷电状况：,.,当pHpI,溶质带正净电，朝阴极泳动，和电渗方向相同，粒子迁移总速度比电渗快；当pHpI，溶质带负净电，移向负极，和电渗方向相反，粒子迁移总速度比电渗慢。必须比pI高或低一个pH单位。pI1pH=pI，在等电点pI时,正负解离相等，净电荷为0；粒子迁移速度和电渗速度相同。,复习：蛋白质的等电点,.,表：6个合成小肽的计算电荷和等电点,.,.,影响进样过程，特别是采用电动进样方法。,缓冲溶液的种类：影响离子的迁移和分离,表：不同阴离子钠盐缓冲溶液测得的电流和电渗迁移率,cit3-柠檬酸,尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。,.,缓冲溶液的浓度浓度增加，会引起溶液粘度、溶质、扩散系数及Zeta电位等的变化，缓冲溶液浓度的增加对柱效的影响比较复杂。在恒定pH值下，浓度增加，（扩散层变薄），电渗率降低，溶质的迁移速率下降，迁移时间延长。分离效率提高。浓度的增加，导电的离子数增加，在相同的电场下毛细管的电流值增加，焦耳热增加。,总之：在一定浓度范围内，增加缓冲溶液的浓度可以提高柱效和分离度，并可以抑制管壁的吸附作用。常用浓度：10200mmol/L,.,CZE特点：操作简单、快速、分离效率高。应用广泛，适用于具有不同淌度的带电粒子的分离。分子量范围：从十几的小分子到几十万的生物大分子。不足：不能分离中性分子！,添加剂：改善管壁或溶质的理化性质，优化分离条件。表面活性剂：如SDS、季铵盐等；有机溶剂，如甲醇、乙腈等；两性离子，如三甲铵基甲内盐等；金属盐，如K2SO4、LiCl等手性试剂，如环糊精、冠醚、胆汁酸盐等,.,应用实例例1毛细管区带电泳分离五种碱性蛋白。例2三种手性药物的对映体拆分,.,小结：,.,三、胶束电动（毛细管）色谱（Micellarelectrokineticchromatography,MEKC(Micellarelectrokineticcapillarychromatography,MECC）,胶束电动色谱：是以胶束为假固定相的一种电动色谱法，是电泳技术与色谱技术的结合，因在毛细管中进行，又称为胶束电动毛细管色谱。,.,1.胶束的形成和特性,表面活性剂：由亲水基和疏水基组成。疏水部分为直链或支链烷烃；亲水部分由阳离子、阴离子、两性离子基团组成。,临界胶束浓度（CMC）：表面活性剂开始聚集形成胶束时的浓度。不同的表面活性剂CMC不同，形成的胶束的形态也不相同。,胶束具有团状结构，疏水性的链端向里，带电荷的亲水端朝向缓冲溶液。具有增溶作用。,.,表：常用的表面活性剂,聚集数n：形成一个胶束离子所需的分子数。聚集数一般在40-140个之间。,.,2.分离机理把离子型表面活性剂加到缓冲溶液中，使形成离子胶束。胶束在毛细管中起准固定相的作用，使中性溶质在流动相（水相）和准固定相（胶束相）中进行分配，由于溶质在胶束中有不同的保留能力而产生差速迁移，从而实现分离。,.,说明：（1）离子型胶束表面带电荷。在电场作用下也要发生电泳而移向阳极或阴极，如SDS表面带负电荷，朝阳极方向泳动，和电渗方向相反。但在大多数情况下，电渗速度大于胶束的电泳速度，所以胶束实际的移动方向朝向阴极。（2）对于中性分子来说，分离仅受溶质进入和离开胶束这一行为的影响。例如：阴离子胶束迁移方向与电渗流相反，溶质与胶束的作用力越强，迁移时间越长。溶质的疏水性越强，与胶束间的作用力越强，迁移时间越长。,.,用于MEKC的胶束的基本要求：(1)生成的胶束稳定性要好，与溶质的缔合速度快，减小峰扩散。(2)形成的胶束必须是均匀、透明的溶液，能透过紫外光；紫外检测(3)胶束的粘度要小；不影响电渗流和分离度(4)表面活性剂的CMC要小，不增大电流,.,在MEKC中控制选择性的方法（1）使用不同的表面活性剂SDS可用于大多数中性溶质的分离；强疏水性溶质可选用极性强的胶束体系如胆酸盐；对易被管壁吸附的大分子溶质，可选用阳离子胶束；分离离子性溶质时，要选择与溶质电荷相反的胶束，才能相互作用进入胶束。,.,（2）缓冲溶液的选择缓冲溶液体系的改变可以改变溶质在两相间的分配系数，从而对容量因子和迁移产生影响。流动相的改变包括缓冲溶液种类、成分、pH值和离子强度。pH值不能改变SDS的荷电情况，因此不影响胶束的泳动速度。,.,（3）使用添加剂（1）手性选择剂（2）尿素、金属离子和硼酸盐（3）有机溶剂，如甲醇、乙腈等，控制溶质胶束之间的相互作用。,.,MECC的特点（与HPLC比较）（1）能同时分离不带电的中性分子和荷电粒子，并可用于强疏水性溶质的分离。是HPCE应用较多和较广的操作方式。（2）分离效率高，HPLC的柱效为5，00025，000理论塔板数；MECK的柱效为50，000500，000理论塔板数。与毛细管GC接近，使分离复杂混合物成为可能。,.,四、凝胶毛细管电泳法（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）,用凝胶物质作为支持物进行电泳的方式，称为凝胶电泳。平板凝胶电泳毛细管凝胶电泳：在毛细管内充有凝胶或其它筛分介质（凝胶柱），流经凝胶的物质，原则上按分子的大小分离。,.,凝胶介质：是一种固态胶体分散体系，由网状结构和共聚其中的溶剂所组成。凝胶物质具有多孔性，有一种类似分子筛的作用。通过它的物质会按分子的大小逐一被分离开。,凝胶,无机凝胶：多孔硅胶、多孔玻璃有机凝胶：,葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）纤维素衍生物,.,特点：柱效高凝胶粘度大，抗对流，可减小溶质扩散；可采用短柱分离溶质与凝胶（或添加剂）可生成络合物，使分离度增加，防止溶质在管壁的吸附并减小电渗流。和常规的SDS-PAGE相同，毛细管SDS-PAGE可提供丰富的分子量信息，具有更好的定性分析性能。样品用量少，可以实现自动化，可用于大分子物质的微制备和馏分收集。缺点：柱制备较困难，寿命偏短。,.,应用：CGE在分子生物学和蛋白质化学上有十分广泛的应用。在分子生物学上实现了包括寡聚核苷酸纯化、反应基因治疗、DNA测序和PCR产物的分析。在蛋白质化学方面用于多肽和蛋白质的分子测量，原蛋白和SDS结合蛋白的分离等。用于其它带电物质的分离，并可通过加入添加剂改变分离的选择性。如手性添加剂、离子对试剂、络合试剂改变,.,.,CEC是毛细管电泳法技术和HPLC理论基础结合的产物，是最新的HPLC方法。1981年出现，90年代才开始发展。它快速、经济、应用广，是最有前途的分析方法。,五、毛细管电色谱法（CapillaryElectrochromatography,CEC）,分离机理:CEC是在空管CZE中填充或涂布色谱固定相，依靠色谱和电场两种作用力，依据样品组分的分配系数和电泳速度的差别而分离。柱效可达106片/米。,.,CEC介质的选择首先是固定相的选择，其次是流动相或缓冲溶液的选择反相CEC：固定相：C18或C8，流动相：乙腈水或甲醇水改变流动相的组成比例，导电大小、pH、散热能力、吸收背景等来改善分离。关键技术：毛细管柱的填充。,.,等电聚焦毛细管电泳法（capillaryiso-electricfocusing，CIEF）,1.分离机理类似蛋白质的分子，其荷电状况使介质的pH而定，在其等电点（pI）时，蛋白质分子表现为零电荷。不同的蛋白质有不同的pI值。当处于pHpI的介质中时，其迁移就停止。如果介质的pH值是位置函数（pH值的位置梯度），就可以使具有不同pI的分子聚焦在不同的位置上不做迁移而被分离。这就是等电聚焦的分离过程。,.,CIEF是在毛细管中进行的等电聚焦。特点：具有极高的分辨率，可以分离pI0.01pH单位的两种蛋白质。pH值的位置梯度由两性电解质混合物作为载体电解质。,.,运行三步：进样、聚焦、迁移关键：减小电渗流找到使分离区带迁移的办法。,.,高效毛细管电泳仪的主要组成：高压电源；缓冲液池(样品池）；毛细管柱；铂电极；检测器；数据处理系统，（恒温系统）,20.3HPCE仪器的基本结构,.,一般流程：预平衡、进样、分离、检测和数据处理,.,高效毛细管电泳仪实图,.,.,高压电源：采用（030）kV连续可调的直流高压电源，电压输出精度应高于0.1。高压电源应能够切换极性。电极：两个相同的直径0.51mm的铂丝制成，可用注射器针套代替铂丝。一般一端为高压电极，一端接地。,注意！高压电的安全保护问题措施：注意保持干燥、隔离或适当降低分离电压。,一、高压电源,.,二、毛细管柱,管材要求：化学和电惰性，能透过紫外和可见光，有一定的韧性，易于弯曲，耐用而且便宜。,常用管材：聚四氟乙烯：能透过紫外光，柱均匀性差。玻璃：电渗最强，杂质含量较高石英：,.,柱参数：内径：2575m柱长：70cm管壁的厚度：,石英本身：涂在外测的聚酰亚胺：几个m,细柱子的最大优点：（1）减小电流，因此能减少自热（焦耳热）。（2）增大散热面积（侧面积/截面积），因而能加快散热，减小径向扩散，保持电渗流型为扁平型，提高柱效。,厚壁（375m）,薄壁（150m）,.,用石英毛细管作电泳分离时，会遇到两种现象（1）电渗：适当控制（分离大分子蛋白）（2）吸附：予以消除消除吸附方法：毛细管壁改性是限制溶质吸附的一种有效手段管壁静态改性：在管壁涂渍亲水聚合物可以减少电渗同时减少吸附。管壁动态改性：改变缓冲溶液和加入添加剂,.,对CE进样技术的要求：进样时不能引入显著的区带扩张，以确保系统的高效。进样区带宽度大体是柱长的12。样品量必须100nl，否则易造成过载。,三、CE的进样技术,直接柱头进样的进样方式,电动进样（电迁移进样）气动进样（压力进样）扩散进样：浓差扩散原理,.,毛细管的阳极端（假设电渗流向接地端移动），先不与缓冲溶液接触，而直接置于样品溶液中，然后在很短的时间内施加进样电压（为分离时操作电压的1/5或1/3），使样品通过电迁移进入毛细管。,1.电动进样（也称电迁移进样）,通过改变进样电压和进样时间控制样品的进样量。,.,一定时间t进样的量Q（g或mol）可以用下列公式计算：,ep组分的电泳淌度os组分的电渗率V外加电压r毛细管内径c组分的浓度t进样时间L毛细管的总长度,.,特点：进样装置简单，不需要附加设备，在介质粘度很高时使用更加有利。是凝胶电泳进样的唯一方式。可用于痕量富集。其突出的特点为实际的进样量与组分的表观淌度有关。存在“歧视效应”，即电泳淌度大的组分进样量大，反之则小。,.,三种办法：（a）在进样端加压（b）在出口端减压（c）调节进样槽和出口槽之间的相对高度使之产生虹吸现象。,2.气动进样（压差进样）:最常用的进样方法,特点：不存在“歧视效应”，进样量不受样品基质的影响，应用最广泛。,.,进样体积可通过Hagen-Poiseuille方程求出。,P毛细管两端的压力差d毛细管的内径t进样时间缓冲溶液的粘度L毛细管的总长度,进样的重现性优于1%2%RSD！,进样量是通过毛细管截面的压差、样品组分的浓度、毛细管的尺寸、缓冲溶液的粘度和进样时间的函数。与样品的淌度无关。,.,缓冲溶液池：小玻璃瓶或聚四氟乙烯塑料瓶（15ml）,带螺帽的，要便于密封。,.,四、CE的检测器,CE对检测器的要求：既能作灵敏检测，又不使谱带展宽。（死体积小）一般采用柱上检测。,CE检测器方法,紫外可见光检测器二极管阵列检测器荧光检测器（激光诱导荧光）电化学检测器质谱检测器其他,电导检测法安培检测法电位检测法,.,1.紫外可见检测器：最常用,除去保护层,特点：通用性好，特别是对蛋白质的适用很强。,类型：固定波长可变波长DAD,.,A=Ecl,增加光程，提高检测灵敏度,.,特点：（1）多波长信号检测（2）峰纯度的确定（3）峰的定性确证（4）未分离的峰的定量：峰消除或信号扣除的方法,2.二极管阵列检测器消色差透镜把光聚焦在毛细管上，透过光束被一个衍射光栅色散到光二极管阵列上（211个）。可获得时间波长吸光值三维电泳图。,.,3.激光诱导荧光检测器：灵敏度最高,优点：激光光强度大，单色性、相干性好；聚焦性能好，易于校准并减小光的散射；可以使用更小孔径毛细管；灵敏度高，检测限达，可实现单细胞检测。缺点：通用性差，适合DNA检测，样品需要衍生化。,检测方法：把一束激光发出的辐射通过短聚焦透镜或显微物镜聚焦到毛细管壁上，通过一个棱镜系统或者（显微物镜（光导纤维）将产生的荧光收集到一个和激发光束成90度的位置上。,.,分离荧光和反射光,采用前照明显微镜结构，通过同一物镜收集荧光发射，提高荧光的收集效率，减小背景干扰。,激光诱导荧光显微镜检测系统,可实现分子水平级检测！,.,消除样品、毛细管管壁界面产生的散射光，以减小背景信号的产生。比普通在柱检测灵敏度高4个数量级，质量检测可达几个分子级。,激光诱导荧光柱后鞘流池检测系统,鞘流的成分与毛细管缓冲液相同,.,5.电化学检测器：具有氧化还原性质的物质电势检测器（EPD）安培检测器（AED）,柱后ECD柱上ECD柱头ECD抑制ECD,柱后EPD柱上EPD,4.电导检测器（ECD）：无机离子和较小有机离子检测,.,Ag/AgCl参比电极,饱和甘汞电极参比电极,.,6.质谱检测器：联用技术,电喷射离子式质谱：由于可以确定105道尔顿的分子，对蛋白质的鉴别特别有用，被视为与毛细管电泳联用的首选仪器。接口技术：毛细管端部的电场强度约为4kV，对立电极的电场强度约为1kV。从毛细管里出来的样品溶液被驱散后进入一个有高电荷微滴的喷雾器中，这就是所谓的电喷雾。,.,表：毛细管电泳检测器性能,.,典型的实验步骤：（1）将运行缓冲液充满毛细管；（2）移去进样端缓冲液池，用样品池代替；（3）用电动或压力进样方式进样；（4）将进样端缓冲溶液放回；（5）毛细管两端加操作电压进行电泳分离；（6）分离样品迁移至检测窗检测，记录数据和处理。,一般流程：预平衡、进样、分离、检测和数据处理,.,五、定性定量分析,1.定性分析采用迁移时间或淌度为定性参数。使用淌度的重现性更好。,表：影响迁移时间重现性的因素,.,2.定量分析峰高或峰面积为定量参数。峰面积更准确。峰面积的重现性对定量分析是关键。一般在好的操作条件下，峰面积的RSD2。,表：影响峰面积重现性的因素,.,定量方法：内标法复习：内标法定量，定量准确。适合小进样量，进样重复性差的方法。方法学验证：准确度精密度线性范围专属性,.,近年来毛细管电泳在药物分析中的应用得到了迅速发展，在中药材、中成药制剂、西药复方制剂及生物技术产品等药物和制剂的分离、鉴定和分析中，显示了高效、快速的特点，正越来越受到重视。,20.4CE在药学中的应用,一、多肽和蛋白质类药物二、中药及中药复方制剂三、化学药物及其复方制剂四、抗生素类药物五、体内药物及代谢分析六、电泳指纹图谱,.,CE用于中成药分析时，除分离柱效高和分析时间短外，由于毛细管柱容易清洗、不易产生柱污染，因此可以用于如蜜丸等中药制剂的分析，在样品前处理时也比HPLC法简单。对分析成分复杂的中药复方制剂具有很大的优越性。,二、中药及中药复方制剂,应用范围：生物碱、黄酮及其苷、各种苷类、香豆素类、酚酸类等。方法：CZE和MECC为主,.,生物碱是植物中一类重要的化学成分，在植物中分布较广。已知的生物碱约3000以上。生物碱类能解离带正电荷，可采用CZE分离模式。植物中的生物碱结构极为相似，有时pKa差值很小，除可根据pKa值不同选择缓冲溶液pH值外，还可适当增加一些添加剂以增加选择性和分离度。,1.生物碱,.,例1：黄连成药中7种小檗碱生物碱的CZE分离,分离条件：柱：57cm75m分离电压：14kV检测波长：254nm低压进样：2s柱温：30电泳缓冲液：50mmol/LNaH2PO4-甲醇（65：35）,.,缓冲溶液：磷酸二氢钠毛细管：6075m,例2：CZE同时分离17种碱性药物,.,毛细管电泳法用于中药及生物样品分析的优点,（1）它具有柱效高、进样体积小等特点。（）抗污染能力强。分析中药样品时，前处理简单，甚至于勿需前处理。医学诊断、药理研究的血、尿样等。（）分析运行成本低。（）特征性强。例如:用CE分析冬虫夏草获44个峰，很易区别蛹虫草、人工培养品、伪品、次品等。而用HPLC法只能获得十几个色谱峰,.,例冬虫夏草的毛细管区带电泳分析,冬虫夏草为麦角科植物冬虫夏草菌的子座及其寄主虫草蝙蝠蛾的幼虫尸体的复合体。子座出自寄生主幼虫的头部。主产地四川、青海、云南、贵州等。主要成分除脂肪、蛋白外,含不饱和脂肪酸、虫草酸、虫草素（核苷类）等。,子座（夏草菌）,虫体(虫草蝙蝠蛾）,.,各种虫草的毛细管电泳对比图,冬虫夏草的子座,冬虫夏草的虫体,.,冬虫夏草,亚香棒虫草,蛹虫草子座,.,手性对映体的存在是自然界的普遍现象，在有机化学、药物化学和生物化学等领域尤其突出。以药物为例，大约有50的药物是手性的。临床应用的手性药物，除天然和半合成药物外，人工合成的含手性药物仍以外消旋体供药为主。在外消旋体药物中各对映体的药理活性通常具有较大差异。,1.手性药物的分离,三、化学药物及其复方制剂,.,（1）治疗作用完全依赖一种异构体。（2）药理作用的差别不大，定性、定量都相近。（3）药理作用的特性相似，但反应强度有明显差别。（4）药理及（或）毒理作用存在质的差别。例如：R-反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；,对映体的药效学差别，将对合理用药与新药开发产生重要影响。纯异构体将可发展成为副作用较小的新药。,对映体的药效学差异，在质与量上都因药而异，可归纳为四类：,.,对映体的拆分方法：,非色谱类方法：根据物理化学性质差别色谱法：已成为对映体拆分的一个主要工具，包括所有的色谱方法（TCL,GC，HPLC，超临界流体色谱法，电泳法）。,HPLC拆分法：（引入不对称中心）间接法：与手性试剂在柱前衍生，形成一非对映异构体对直接法：使用手性固定相或手性流动相拆分的方法。,.,药物拆分的主要用途：（1）生物体液中药物对映体的分离分析，各对映体的药物动力学及体内处置过程；（2）药物对映体的制备，给实验室和临床提供纯的对映体，以进行单个对映体的药理学评价。（3）药物对映体的质量控制分析。,.,手性分离基本策略手性药物在拆分前的对映体通常以镜像存在或以外消旋体的形式存在。用常规分析和制备方法不能将其拆分，需要引入不对称（即手性）环境。不管是哪一种色谱法，其基本原理大多数是基于把对映体的混合物转化成非对映体，然后利用它们在物理化学性质上的差异使之分开。为了使对映体转化为化学和物理化学性质不同的非对映体，多宜提供一种手性源，使欲拆分的对映体（样品）、手性作用物（比如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。,.,用CE拆分对映体的策略：一是手性消除：与手性试剂进行化学反应，转化成非对映异构体，用普通的CE方法分析。一般采用柱前反应的方法，产物的手性可能不能恢复。二是构建手性环境：使用手性添加剂、使用手性填充毛细管柱和使用手性涂层毛细管柱。,常用的手性选择剂有：环糊精、冠醚、胆酸盐、手性混合胶束、手性选择性金属络合物、蛋白糖等7类型。目前应用最多的是以环糊精为手性选择剂的毛细管区带电泳。,.,-环糊精（-CD）：是7个(D)吡喃型葡萄糖单体以1，4脱水缩合联结而成的环状分子。该分子结构中所含环状空腔具有手性识别能力，能以包结的方式与对映体分子形成非对映体主客体复合物，从而在色谱过程中造成滞留的差异，达到分离的目的。,环糊精常用的修饰方法之一，是用烷基、羟烷基、酰基等取代基修饰-环糊精(-CD)中的羟基5,6,以改变CD的空腔尺寸,增加手性分子与-CD之间的相互作用,提高-CD的手性识别和拆分能力。,内部疏水，外部亲水,.,手性CE和手性HPLC相比的优点：避免了HPLC需要将大量手性试剂加入流动相中，或使用昂贵的特殊固定相的缺点；CE使用的毛细管价格较低，使用溶剂仅需几毫升，样品量极微。CE在准确度、精密度、检测限、线性范围及重现性等方面均已达到甚至超过了HPLC。,HPCE法：对开发中的新药的对映体的分离和生物体内药物代谢过程中对映体的分离，CE更有其独特的优点。,.,例1：CD-CZE分离肾上腺素等4种胺类化合物的对映体,酚乙醇胺,肾上腺素,异丙肾上腺素,多西拉敏,分离条件：毛细管柱64.5cm50m操作电压：30kV，检测波长：200nm，柱温：25，缓冲液为：50mmol/LTris-H3PO4，20mmol/L二甲基-CD(pH=2.4),.,.,.,摘要:以新型环糊精衍生物单-6-O-苯基胺甲酰基-CD为手性选择剂,用毛细管区带电泳法成功地分离了-CD及常用环糊精衍生物无法拆分的手性药物山莨菪碱。考察了手性选择剂浓度、缓冲液pH值和浓度及有机溶剂对拆分的影响。,手性药物山莨菪碱的毛细管电泳拆分研究,.,2.复方制剂分析,例1：MECC分析复方感冒制剂中的13种药物,电泳分离条件：毛细管柱60cm75m操作电压：18kV，检测波长：214nm，虹吸进样（10cm)缓冲液为：20mmol/L硼酸钠-磷酸二氢钠0.1mmol/L-胆酸钠(pH=9.0）,.,中药的毛细管电泳指纹图谱研究孙毓庆，阮婧华，马欣(沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016),目前，用于中药指纹图谱研究的方法分为色谱法和光谱法两类，以色谱法居多。色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)及气相色谱法(GC)等，其中以HPLC最常用。但用HPLC进行中药成分分析常遇到一些问题。一是由于中药成分复杂，色谱柱易受污染，柱寿命短，且难以再生；二是色谱柱上沉积的污染物，经常以杂质峰的形式出现；三是分析运行成本高；四是对于含极性成分较多的中药，其“指纹”的特征性不强。通常人们对毛细管电泳法(CE)的误解