一般毒性作用试验

5/31/2020,1,一般毒性作用试验,5/31/2020,2,3R原则：ReplacementReductionRefinement,填词游戏,5/31/2020,3,一般毒性毒性,1急性毒性作用2蓄积毒性3亚慢性和慢性毒性作用4局部毒性作用,5/31/2020,4,1急性毒性作用,一、急性毒性和急性毒性试验的目的二、急性毒性试验三、急性毒性分级,5/31/2020,5,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,急性毒性(acutetoxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。,急性毒性作用,5/31/2020,6,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,目的测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度。并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。探求化学毒物急性毒性的剂量反应关系与中毒特征。为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考依据。研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。为毒理学机制研究提供线索。,5/31/2020,7,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,急性毒性试验常用的毒性参数：LD50/LC50Zac（LD50/Limac）Zac为半数致死剂量与急性阈剂量的比值LD84/LD16(或LC84LC16)剂量反应曲线斜率,急性毒性作用,5/31/2020,8,二、急性毒性试验的主要步骤,健康动物的选择性别辨认动物称重、编号和分组剂量设置受试物的配制灌胃中毒体征和动物死亡情况观察LD50的计算,5/31/2020,9,二、急性毒性试验,(一)试验动物原则：急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。-相似性原则动物易于获得-可获得性原则品系纯化-重复性和均一性原则价格较低和易于饲养等条件。-相容或相匹配原则,5/31/2020,10,二、急性毒性试验,1试验动物的种属和品系最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。,急性毒性作用,5/31/2020,11,二、急性毒性试验,试验动物的年龄和体重：急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20。,急性毒性作用,5/31/2020,12,三、急性毒性试验,3.试验动物的性别：急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。,急性毒性作用,5/31/2020,13,二、急性毒性试验,4.动物数量与随机分组：大、小鼠等小动物每组10只狗等大动物每组6只分组原则随机化原则5.禁食：经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食大鼠、小鼠隔夜进食；染毒后禁食4h大动物每日上午喂食前染毒染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水。6.实验动物的预检：选择健康动物12周的检疫期,急性毒性作用,5/31/2020,14,二、急性毒性试验,（二）试验动物的饲养环境恒定的温度：223湿度：3070%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格,急性毒性作用,5/31/2020,15,二、急性毒性试验,（三）染毒途径的选择:染毒途径（exposureroutes）的选择需考虑：1、模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；2、有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；3、受试物的性质和用途；4、各种受试物毒性评价程序的要求等。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。,急性毒性作用,5/31/2020,16,二、急性毒性试验,经口(胃肠道)接触:灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只家兔不超过10ml/2kg狗不超过50ml/10kg吞咽胶囊:经呼吸道接触:静式吸入动式吸入经皮肤接触:注射途径接触:,急性毒性作用,5/31/2020,17,二、急性毒性试验,（四）染毒剂量与分组:1查阅文献了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。,急性毒性作用,5/31/2020,18,二、急性毒性试验,（四）染毒剂量与分组:2预试验设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。根据确定的剂量组进行染毒。根据预试验的死亡资料确定组距。,5/31/2020,19,二、急性毒性试验,（四）染毒剂量与分组:3正式试验;一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。,急性毒性作用,5/31/2020,20,二、急性毒性试验,（五）试验周期与毒效应观察1.中毒症状,5/31/2020,21,二、急性毒性试验,（五）试验周期与毒效应观察:2.体重在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物应在观察期14天内称量其体重的变化以便了解受试物引起毒效应的持续时间。,急性毒性作用,5/31/2020,22,二、急性毒性试验,（五）试验周期与毒效应观察:3.病理检查及其他指标:急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。,急性毒性作用,5/31/2020,23,二、急性毒性试验,（五）试验周期与毒效应观察4.死亡和死亡时间重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。,急性毒性作用,5/31/2020,24,LD50的计算方法,改进寇氏法霍恩法序贯法Bliss法,5/31/2020,25,改进寇氏法,是利用计量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法，又称平均致死量法。本法要求每个染毒剂量组动物数要相同，各剂量组组距呈等比级数，死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率80%。,5/31/2020,26,计算公式如下：M=Xk-i(p-0.5)Sm=i(pq/n)1/2M:lgLD50i：相邻两剂量组之对数差值Xk：最大剂量的对数值；q：存活率p：各组死亡率之和;n:每组动物数,5/31/2020,27,组别剂量对数动物数死亡数1.17611001.25611021.33611051.41611071.4961109,5/31/2020,28,M=Xk-i(p-0.5)=1.4961-0.08（2.3-0.5）Sm=i(pq/n)1/2=0.08（0.16/10+0.25/10+0.21/10+0.09/10）1/2,5/31/2020,29,霍恩法,利用剂量对数与死亡率的转换数呈直线关系而设计的方法，又称平均移动法或剂量递增法。该法使用动物数少，可直接查表求出LD50。该法推荐使用4个染毒剂量，要求每组动物数相等，一般用4-5只动物，且剂量组按等比级数排列。,5/31/2020,30,序贯法,又称平均数法、阶梯法或上-下法，先以一个剂量进行实验，若动物死亡，则以下一个较小剂量试探；若动物存活，则以较大剂量试探，依次类推，最终求出LD50。,5/31/2020,31,LD50=(xf)/nn:使用的动物总数；X：每个剂量组的剂量f:每个剂量组使用动物数,5/31/2020,32,举例：小鼠经口给与某化学物染毒，10mg/kg剂量试探，预计使用4个剂量组，剂量组距对数值0.2，设计使用12只动物，结果如下,5/31/2020,33,xf=12.592+105+7.944+6.311该法优点是节省动物，一般12-14只左右动物即可完成实验。缺点？,5/31/2020,34,二、急性毒性试验,(六)经典急性毒性试验的局限性1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。,急性毒性作用,5/31/2020,35,三、急性毒性评价,急性毒性作用,5/31/2020,36,三、急性毒性评价,急性毒性作用,5/31/2020,37,一、基本概念二、蓄积毒性试验方法及其评价,蓄积作用及其评价,2蓄积毒性,5/31/2020,38,化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。,一、基本概念,5/31/2020,39,某些毒物多次以小剂量反复进入体内，可表现出机体对该毒物的反应性增强，即一次染毒不引起反应的剂量，如多次重复染毒，则可能引起明显的反应甚至死亡。毒物的蓄积与进入机体的毒物剂量、重复染毒的间隔时间、毒性及代谢特点和机体反应特性条件有关。,5/31/2020,40,蓄积作用实际上有二个含义：物质蓄积(materialaccumulation)功能蓄积(functionalaccumulation),蓄积作用及其评价,一、基本概念,5/31/2020,41,物质蓄积：实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能够检测到机体内存在该化学物或代谢产物功能（机能）蓄积：有的化学物在长期接触后，机体内虽不能检测到机体内存在该化学物或代谢产物，却出现了慢性毒性作用。,5/31/2020,42,功能蓄积可能,是由于机体内的化学物或其代谢产物的数量极微，不能检测出物质的蓄积或者是由于每次机体接触化学物后所引起的损害累积所致,5/31/2020,43,蓄积作用的检测方法,应用化学分析或其他技术测定化学物进入机体后在体内含量的变化过程。该方法可确定化学的半衰期生物学方法：即将一次染毒与多次染毒所产生的生物学效应进行比较，故该法所检测的蓄积性不能区分功能蓄积和物质蓄积。,5/31/2020,44,二、蓄积毒性试验方法及其评价,化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。,5/31/2020,45,(一)蓄积系数法蓄积系数(accumulationcoefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量ED50(1)的比值，即：KED50(n)/ED50(1)KLD50(n)/LD50(1),蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,5/31/2020,46,(2)蓄积系数法常用试验方案,固定剂量法剂量递增法剂量固定的20天蓄积法,5/31/2020,47,固定剂量法,动物：常用大鼠或小鼠分2组：染毒组和对照组每组至少20只，雌雄各半。固定剂量：1/201/5LD50每日固定剂量、定时和相同途径染毒终止时间：试验组累计发生一半动物死亡。如接触剂量已累计达5个LD50，也可终止。实验期限：最短为25天，最长100天。,5/31/2020,48,剂量递增法,动物：常用大或小鼠40只（或更多）分组：染毒组和对照组每组至少20只，雌雄各半。终止时间：试验组累计发生一半动物死亡。在第21天也可结束，因累计剂量已达5.26LD50。试验最长为28天。,5/31/2020,49,每日接触剂量（LD50）,接触天数,四日接触总剂量（LD50）,累积接触总剂量（LD50）,1,45,89,1213,1617,2021,2425,28,0.100.150.220.340.500.751.12,剂量递增法使用剂量表,0.401.001.903.265.268.2612.74,5/31/2020,50,分组剂量1/20LD501/10LD501/5LD501/2LD50对照组,染毒1次/d20d,n10（）10（）10（）10（）10（）,剂量固定的20天蓄积法,5/31/2020,51,5/31/2020,52,局限性,不能判断化学毒物的蓄积是物质蓄积或功能蓄积；蓄积系数法，如果以死亡为指标，用LD50表示生物效应，有急性试验的局限性，可能漏检某些指标。如有机磷农药，蓄积性小，但抑制AchE,5/31/2020,53,一亚慢性毒性作用：亚慢性毒性的概念亚慢性毒性试验的目的亚慢性毒性试验的设计二慢性毒性作用：慢性毒性的概念慢性毒性试验的目的慢性毒性试验设计,3亚慢性毒性试验,亚慢性和慢性毒性试验,5/31/2020,54,(一)概念：亚慢性毒性(subchronictoxicity)是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化合物所引起的毒性效应。慢性毒性(chronictoxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。,一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的,5/31/2020,55,（二）试验目的：1.确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱，对在急性及亚急性毒性试验中发现的毒作用提供新的信息，并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用；2.研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；3.研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值;4.研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性;5.亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据;6.确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。,亚慢性和慢性毒性试验,一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的,5/31/2020,56,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（一）实验动物选择,亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性毒性试验年龄：大鼠80100g狗812月小鼠1015g数量：小动物20大动物6性别：雌雄各半,慢性毒性试验年龄：大鼠5070g狗80只）染毒剂量（高剂量组死亡率10%，低剂量组不引起任何中毒反应）染毒途径指标观察,5/31/2020,66,观察指标,一般综合指标：动物一般行为、体重摄食量变化、中毒体征和死亡情况。血液及生化检验：常规项目包括血红蛋白、红细胞数、白细胞、血清酶活力等。脏器重量：如心、肝、肺、肾等病理学检查：试验结束时处死所有动物进行大体尸检，如未见明显病变，可将高剂量组和对照组的主要脏器进行病理学检查。,5/31/2020,67,3慢性毒性试验,慢性毒性的概念慢性毒性试验的目的慢性毒性试验设计,5/31/2020,68,(一)概念：慢性毒性(chronictoxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。,一、慢性毒性试验的概念、目的,5/31/2020,69,（二）试验目的：1.确定受试物慢性毒性的效应谱，对在急性及亚急性毒性试验中发现的毒作用提供新的信息，并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用；2.研究受试物慢性毒作用的靶器官；3.研究受试物慢性毒性剂量反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考