现代实验室诊断在血液病学中的应用及地位课件

甘肃省人民医院血液科张启科、现代实验检验学在血液学中的重要地位、现状、临床血液学和血液检验是多缝交叉、实践性强、发展迅速的学科。 随着国内外研究的深入，血液学取得了飞跃性的发展，如白血病亚型研究已深入到基因染色体以及微观领域。 临床医生无法用肉眼判断分类、治疗方案、预后等重要问题。 因此，检验科实验室的结果尤为重要。 在诊断进展过程中，骨髓活检可以弥补骨髓穿刺不足的骨髓细胞成分和原始细胞的分布状况可以观察细胞形态，使病理诊断变得容易对再生障碍性贫血、骨髓异常增生症的诊断有重要意义，骨髓坏死、骨髓脂肪变化也有诊断意义。 实验室检查的意义、白血病分子检查的临床应用、免疫学检查：确定细胞系和分化免疫学检查：确定细胞系和分化，AML1-ETO，t(8； 21)(q22； q22)68%的原发性AML在M2中的阳性率为2040%，在M2b中的阳性率为90%比M4和M1稀少，MDS和骨髓增生综合征AML1-ETO白血病细胞具有一定的分化能力，可分化为比较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞， 对化疗反应敏感的AML1-ETO患者对大量酸中毒疗效高，缓解率高，无病生存期长，预后好于其他AML亚型(M3除外)，AML1-ETO，对首发患者t(8； 21 )检测与AML1eto融合的基因对预后判断和制定治疗方案非常重要的AML1eto定性结果不能实时反映体内AML1eto水平在评价患者MRD情况的RQ-PCR中。 连续定量AML1-ETO转录本水平可以确定参与早期治疗的患者，以防止血液学复发； 17)(q22； q21 )，98%M3患者阳性继发t(15； 17 )随后发现4种M3特异性累及RAR的致突变性染色体移位： t(5； 17)(q35； q21 )、t(11； 17)(q13； q21 )、dup(17)(q21.3； q23 )、t(11； 17)(q23； q 21 )在分别产生NPM rar、NuMA-RAR和plzfrar、stat5b rar融合基因的临床上，具有plzfrar或stat5b rar融合基因的患者对ATRA治疗不敏感，其馀3种染色体转位患者经ATRA治疗完全缓解， PML rar、RT-PCR检测PML rar为敏感、特异的APL诊断方法，也可用于治疗后MRD监测。PML-RAR阳性分子复发早于临床复发36个月，保证RQ-PCR能有效地反映患者发病、治疗、缓解、复发过程中白血病细胞的负荷，为临床采取进一步治疗措施， Fms-relatedtyrosinekinase3FLT3在MRD监测中价值高于RT-PCR，是III型受体酪氨酸激酶家族(包括c-FMS、PDGFR和c-KIT )的成员之一， 据报道在造血过程中对造血细胞增殖和生存发挥重要调控作用的FLT3-ITD和D835突变，AML的阳性率分别为24%(385/1585 )和7%(30/429 )，总阳性率超过30%，成为AML中最普遍发生突变的靶基因FLT3突变与临床预后密切相关，特别是60岁以下的AML患者，发现FLT3突变患者预后差，可以独立于核型(p13； q22 )和t(16； 16)(p13； q22 )主要见于M4Eo，10%不伴有异常嗜酸细胞M4，因M2CBF-MYH11融合蛋白干扰核心结合因子(corebindingfactor，CBF )转录激活作用而致CBF-MYH11患者化疗敏感，预后良好，故检出率q34 )主要见于M2或M4，也见于M1，MDS-RAEB伴有DEK-CAN的患者年龄一般较轻，预后较差的患者的分子监测有助于判断患者的预后，调整治疗方案的WT-1基因高表达， Wilsumtumor1是无特异分子异常急性白血病患者的理想MRD测定指标，其基因高表达者预后差，且表达程度与预后有关，BCR-ABL，t(9； 22)(q34； q11)1530%成人ALL和35%儿童ALL9号染色体的裂点与CML相同，但22号染色体裂点具有异质性，该融合蛋白p90刺激细胞增殖的能力强于p10。 转基因试验中p190诱发的白血病具有发病快、发展快、恶性程度高的特点，BCR-ABL ALL患者预后差，5年生存率为20%，因此这些患者需要缓解后进行骨髓移植治疗，BCR-ABL、BCR-ABL、巢式RT-PCR 患者血液学复发前624个月骨髓检查呈阳性。 RQ-PCR动态观察患者治疗后BCR-ABL转录水平的变化，反映疗效。MLL相关融合基因、MLL基因的分子异常见于5.2%AML、22%ALL和混合性白血病和淋巴瘤，也见于相关白血病的治疗，特别是接受topoisomeraseII抑制剂治疗的患者MLL基因与五十多种染色体转位有关，产生不同的融合蛋白，各自的融合蛋白特定最常见的是t(4； 11)(q21； q23)MLL-AF4融合基因ALLt(9； 11)(p22； q23)MLL-AF9融合基因AMLt(11； 19)(p13； q23)MLL-ENL融合基因AML和ALL，血液病临床分子标记检查(NHLALL )淋巴系白血病Acutelymphoblasticleukemia (急性淋巴细胞白血病) Lymphoproliferativedisorders (淋巴性增殖性疾病) Malignantlymphomas (恶性淋巴瘤)测定意义，帮助诊断18)(FISH，PCR )免疫组化、流式细胞术、鉴别诊断淋巴瘤不同类型的鉴别诊断套管细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma，MCL )母细胞亚型特别是与CD5阳性弥漫性b细胞淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL )的鉴别：分子标记t(11； 14)(FISH，PCR )小细胞性b细胞淋巴瘤的不同类型鉴别，如FL、黏膜相关淋巴组织(mucosaassociatedlymphoidtissue，MALT )淋巴瘤和MCL:分子标记t(14； 18 )、t(11； 18 )、t(11； 14)(FISH，PCR )、淋巴瘤同一类型的亚型鉴别诊断DLBCL基因表达图为育发中心b细胞型(germinalcenterB-cell-like，GCB-DLBCL):5年生存率59%，12q12拷贝数增加(FISH ) 活化b细胞型(activated B- cell-like ABC-dl bcl ):5年生存率30%，3号染色体/3q，18q21-22拷贝数增加/6q21-22缺失(FISH )原发纵隔型(primarymediastinal，PMBCL):5年生存率64%，9p21-22 18)(FISH，PCR )全身系统FL皮肤表现：预后差，t(14 )多见18)(FISH，PCR)MALT2个分子细胞遗传学亚型： t(11； 18 )阴性：不易转化为高级别，临床分期早，根除幽门螺杆菌(Hp )疗效好(FISH，PCR)t(11； 18 )阳性：临床分期慢，侵袭性强，Hp根绝疗效差(FISH，PCR )，染色体和基因的变化，微小残留病， minimalresiduisease(mrd)-微小残留病是指白血病诱导化疗完全缓解后或骨髓移植后残留在体内的少量白血病细胞的状态，是引起白血病复发的白血病细胞负荷的初次诊断-1012形态学缓解-1010以下的分子学缓解-约106-107， 测定MRD的意义，根据细胞负荷调节缓解后的化疗方案早期发现耐药性，早期预测白血病复发评价骨髓移植净化效果为实验研究提供依据，一是染色体核型分析二、荧光原位杂交-FISH三、流式细胞仪-FCM四， 聚合酶链反应技术-PCR五，其他：细胞培养技术、免疫荧光等染色体核型分析、常用染色体显带技术检测染色体变异，但其成功率依赖于标本中分裂成像细胞的数量，因此检测结果各不相同，灵敏度低， 约1:20 fishfluorescenceinsituhybridization用荧光素标记染色体特异性探针和特异性基因的DNA探针，通过与间期核DNA或中期染色体DNA原位杂交识别染色体数和结构异常，定性、定位和相位优点： FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针可长期保存、可同时显示多种颜色等优点，不仅是中期分裂相， interphaseandmetaphasefishdemonstratingavariantofthephiladelphiachromosome.thegeneetsthatarerearangedare : bcr (绿色) abl (orangeonchromosome9) thephtranslationappearsasdualfusion (yellow ) signals . RT-PCR逆转录聚合酶链反应技术利用染色体转位形成的肿瘤特异性融合基因或基因转位作为分子靶，在引物作用下通过聚合酶链反应在短时间内将特异性序列扩增至百万倍，在凝胶电泳中显示优势：特异性、灵敏度大幅提高(10-510-6 )， QRT-PCR-荧光实时定量在PCR、PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积监测整个PCR过程，最后用标准曲线定量分析未知模板的方法。实现了PCR从定性向定量的飞跃，其特异性强、灵敏度高、重现性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点已成为分子生物学研究的重要工具，目前real-timeQ-PCR实验成本高，且各实验室标准不同，因此其广泛应用也受到限制。 MRD检查在AML中的应用，评价AML治疗预后因子诱导治疗后白血病细胞负荷的减少程度和CR时间是提示预后的独立因子MRD检查的目的：预示分子学复发，提前挽救治疗，巩固治疗结束后的MRD检查及其意义，方法标准化：在有经验的实验室中低灵敏度(10-4 ) RT-PCR法PML/RAR()定义：坚固治疗结束后，指间隔4周的次级骨髓标本，在有经验的实验室中，MCR达到9099%的MDR检查结果，决定其后的治疗选择，维持治疗期及其后的MRD检查，MRD检查是适合高危人群患者的低危险标志高危组患者治疗后1年内每隔12个月进行检查，第2、3年内每隔3个月确定目前常用的非定量RT-PCR、Q-RT-PCR的临床应用价值， 调整认为动态监测融合基因定量变化可为评估预后提供有益信息的治疗方案，提示加强治疗的RT-PCR持续阴性与长期生存密切相关时血液学会复发，需要及时治疗的22号染色体、9号染色体、BCR、 监视ABL BCR-ABL基因、干细胞学和实验室检查、展望、MRD对临床治疗战略的指导具体化检查技术的改善，标准化扩大了MRD检查的应用范围，如淋巴瘤、多发性骨髓瘤等进一步深入MRD的实验室研究，如MRD细胞的定位、环境对其成长的影响， 增殖动力学、与正常造血的关系等， 实验医学的发展虽然已经进入分子阶段，