核医学第8章-受体的放射性配基结合分析

第八章放射性配体结合分析受体的RBA细胞表面的分子或受体：的亚细胞成分可以识别并特异性结合生物活性化学信号物质(配体)以激活或启动一系列生化反应，最终导致信号物质的特定生物效应。迄今为止，所有发现的受体都是具有特定氨基酸序列和特定构型的蛋白质。每个受体在细胞上都有特定的宏观和微观分布。(1)引言，(1)受体功能识别一种特定的信号物质，配体，其通过两者的特定组合来表现。识别和接收的信号被精确放大并传输到细胞内部，同时开始一系列细胞内生化反应，最终导致特定的细胞反应并将细胞外信号转化为细胞内信号。受体接收特定的细胞外信号(神经递质、激素、某些药物和毒物等)。称为配体，配体)，并通过受体后面的特定信号传递系统，引起细胞的特定生物效应。因此，它是高等动物适应环境和整体协调各种细胞功能的关键分子。受体及其信号系统参与体内许多生理和病理过程，如肿瘤形成、免疫反应、补体激活等。根据它们在细胞中的位置，所有受体分为：个膜受体核受体。2.受体分类：1.膜受体：膜受体分子通常由三部分组成：细胞外、细胞内和跨膜区，由几至几十个氨基酸链组成。配体从细胞外与受体的细胞外部分或跨膜部分的特异性结合位点结合，引起受体分子构型的改变，并通过膜内部分将信息传递到相应的信息传递机制，引起细胞功能的改变。根据膜受体的跨膜结构，可分为：单链跨膜受体：包括酪氨酸激酶型受体，如各种生长因子受体；非激酶受体，如细胞因子受体。g蛋白偶联受体：受体的氨基酸链7次穿过细胞膜，广泛分布于人体内。离子通道受体：受体的几个组成亚基垂直插入细胞膜，中间形成的间隙是离子通道，如N-胆碱能受体、甘氨酸受体等。核受体是一条氨基酸链，可分为四个功能区：A/B区：在不同受体中差异最大，其主要功能是选择和激活基因转录。C :区与染色体DNA结合的区域，染色体DNA具有特定的氨基酸序列，可以与靶基因上的特定核苷酸序列(称为反应元件)结合。D区：的主要功能是受体在细胞核中的定位。e区：是结合配体并具有转录激活的区域。受体的亚型，受体的亚型：在分子结构上有相似和不同，对某些配体有不同的亲和力，以及不同的生物学效应。在药理学实验和其他研究中，已经发现许多受体具有两种或更多种亚型。只有具有相同内源性配体和高氨基酸序列同源性的受体才能被归类为同一类型的不同亚型。例如，表皮生长因子受体家族包括四个成员：表皮生长因子、HER2、HER3和HER4。受体的数量：占细胞蛋白质总量的10万分之一到100万分之一(一个细胞只有数千个受体分子)。用普通方法很难分离和确定受体分子。配体：指能与受体结合并引起相关效应的化合物。除了与受体本身结合外，它没有其他功能。它不能参与新陈代谢产生有用的产物，也不能直接诱导任何细胞活性，也没有酶的特性。它的唯一功能是通知细胞环境中存在特殊信号或刺激。(3)受体与配体的结合配体与受体的结合是一个分子识别过程。它依赖于氢键、离子键和范德华力。随着两个分子空间结构之间互补程度的增加，I同一配体与不同类型受体的结合会产生不同的细胞反应。例如，乙酰胆碱能刺激骨骼肌，但抑制它。配体可以是神经递质、激素、某些药物等。受体与配体结合的特征。饱和度：细胞上每个受体的数量是有限的，所以如果细胞周围配体的浓度持续增加，与细胞结合的配体将逐渐变得饱和。可逆性：如果受体周围多余的放射性配体在放射性配体与受体结合后被去除(如洗脱或透析)，放射性配体和受体的复合物将逐渐解离，即结合是可逆的。如果向反应体系中加入大量未标记的配体，使其浓度比放射性配体的浓度高得多，大多数已经结合的放射性配体将被取代，放射性复合物将减少，这也表明配体与受体的结合是可逆的。解离的配体是原始形式，没有代谢变化。3、特异性和亲和力：受体特异性：受体具有特异性识别配体的能力，因此只有具有严格构型和构象的配体分子才能选择性地与受体结合。受体的特异性也表现在器官或组织(目标器官)的特异性上。例如，雌激素对子宫和其他器官有兴奋作用，因为这些器官中雌激素受体的数量明显高于其他器官。受体亲和力是指受体与配体的结合能力。受体的高亲和力表明受体和配体结合牢固，不易解离。与效应的一致性：受体的主要功能是调节配体的生物效应。如果一种蛋白质能与一种物质结合而不介导特定的生物学效应，那么这种蛋白质就不能称为受体。配体与受体结合会产生积极的生理效应，这被称为激动剂。配体与受体结合后，阻断内源性配体的积极生理作用，称为拮抗剂或阻断剂。(5)受体受体的生理调节在正常生理条件下处于连续合成和降解的动态平衡中，但是它们的数量和亲和力也会由于疾病和药物作用而改变。1.下调细胞环境中某些激动剂浓度的增加或长期作用，导致相应受体数量的减少和受体对该物质的敏感性或耐受性的降低。如果哮喘患者长期服用-激动剂，并且耐受性增加，则药物作用将减弱。(2)上调细胞环境中拮抗剂的浓度过高或作用时间过长。结果，受体的数量将增加，受体的敏感性将增加，这表现为致敏或戒断后的反弹现象。如果高血压患者长期服用心得安，如果突然停止服用心得安，可能会出现血压升高的反弹现象。由于受体的生理调节是由整体条件下随机的身体状态变化引起的，因此确定受体的数量和亲和力已成为研究病理变化和评价药物疗效的重要内容。受体和疾病、遗传缺陷和免疫异常是受体疾病的常见原因1。基因突变导致受体异常并导致功能障碍，其中大部分是功能减退或完全丧失，伴有家族史和严重疾病。例如，睾丸激素受体基因突变导致受体缺陷导致睾丸完全女性化。2.身体产生针对受体的自身抗体，并激发(例如，格雷夫斯综合征患者产生促甲状腺激素受体抗体，其直接并持续地激发甲状腺促甲状腺激素受体)或阻断(例如，重症肌无力患者产生N-乙酰胆碱受体抗体，其占据但不激发受体)。3.有些疾病具有异常受体，这些受体不是疾病发病的主要环节，而是疾病发病的重要环节。可以采取有针对性的措施来控制疾病。用于甲状腺机能亢进的肾上腺素能阻断剂和用于哮喘的肾上腺素能激动剂。4.受体和肿瘤：一些受体基因可以突变成致癌基因，导致肿瘤；肿瘤中激素受体的存在与否决定了治疗方案(乳腺癌、白血病)。2。受体-配体结合反应的基本原理，RBA(放射性配体结合分析法)的基本原理与红外光谱基本相同定性RBA:通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型、单位点或多位点结合类型、受体与配体的结合特征、反应的可逆性和协同性。定量RBA:基于已知的配体和受体的反应性质，通过结合反应，给出了在一定数量的组织或细胞中能与放射性配体结合的受体数量和平衡解离常数或结合位点数量(最大结合能力)。RBA的优点：高灵敏度：高比活性的配体和高亲和力的受体反应必然会产生高灵敏度的分析技术。氨基丁酸的灵敏度可达10-15摩尔/升；强特异性：受体和配体的结合特异性和特异性保证了方法的特异性；受体制剂的多样性：同一组织或细胞上有多个受体，因此某个组织或细胞制剂可以使用多个配体进行受体分析；动物受体和人类受体是相容的。从动物身上获得的大部分知识可以应用到人类身上。(1)简单单点系统中受体与配体结合的基本规律：对于某一受体，其所有受体具有完全相同的结合特异性和生理效应，所有受体只有一个结合位点，并以1: 1的关系与配体结合，没有明显的正负协同效应。有时，在一个受体系统中有两个(更多)亚型，但结合配体不是选择性的。尽管亚型的生物学效应可能不尽相同，但结合反应显示出完全相同的特征。此时，它也可以被视为一个单位点系统。我们可以看到，RL(复合物浓度)和LT(总配体浓度)不是线性关系，而是曲线关系。对于一定数量的受体(RT)(总受体浓度)固定)和一定亲和力(KD固定)，当配体浓度从零开始上升时，复合物浓度首先迅速上升，然后逐渐减慢，最后大部分受体变成复合物，即受体饱和。这是饱和度曲线。曲线的高度主要反映受体的数量，受体越多，曲线的高度越高；曲线上升的速度取决于配体和受体的亲和力，因此，KD越小(亲和力越大)，饱和曲线上升越快，KD越大(亲和力越小)，饱和曲线上升越慢。(2)斯卡查德映射：在绘制饱和曲线时，将改写为以络合物浓度为横坐标，以络合物与游离配体浓度比/浓度比为纵坐标。对于简单的单位点系统，将获得一条逐渐减小的直线。斯卡查德映射，目前斯卡查德映射主要用于定性，即判断是否存在简单的单位点或其他复杂情况。例如，在同一系统中，同一受体具有两种或两种以上的亲和力亚型，或者该受体具有正协同效应或负协同效应(Scatchard被绘制成曲线)，(3)正协同效应，当一部分受体与配体结合时，相邻受体的亲和力发生变化，如果亲和力逐渐降低，则称之为负协同效应，如曲线(2)，而亲和力逐渐增加，则称之为正协同效应，如曲线(3)。(4)非特异性结合(NSB)上述饱和曲线是由受体和配体的特异性结合形成的。这种组合的特点是低容量和高亲和力，所以很容易饱和。然而，除了特异性结合之外，任何受体样品都会有一些非特异性结合。当分离特异性结合复合物以测量放射性时，这部分非特异性结合放射性将混合在一起，并测量总结合(TB)。在获得特异性结合放射性之前，必须减去非特异性结合。NSB主要来源于对外源蛋白、反应器壁和分离物质的吸附。它的特点是容量大和亲和力低，所以在正常情况下不饱和，即不显示饱和曲线，而是随着配体浓度的增加呈直线上升。(5)受体-配体反应动力学。受体和配体之间的结合反应通常更快(大多在几十秒到几十分钟内)达到平衡。当周围的游离配体急剧下降或未标记配体的浓度急剧上升时，放射性配合物的解离也非常快，这对保证受体的快速反应具有重要意义。(6)竞争性取代反应将另一种化合物加入到受体和放射性配体的反应体系中。如果它能结合受体的结合位点，它将与放射性配体竞争结合受体，这将最终显示放射性配体与受体形成复合物的能力下降，但受体的数量将保持不变，因此它被称为竞争性替代反应。此时，未标记的竞争性配体被称为竞争性试剂，其在与受体结合后不会改变受体分子的结构。IC50值和KI。IC50值：指抑制50%受体与放射性配体结合所需的竞争剂浓度。IC50值大表明竞争剂的抑制作用小。竞争对手的平衡离解常数。KI越小，竞争对手的抑制作用越大。两个或多个(多)位点系统的一个配体可以结合两个以上的受体亚型，并且每个亚型具有相应的KD值(自我研究)。受体放射分析的基本方法，RBA的方法学：一般来说，RBA分析的目的是获得样品中受体的数量RT。定量受体制剂与大量标记的配体反应，使受体饱和。分离受体标记的配体复合物并测量其放射性。受体的结合能力或结合位点的数量根据复合物的放射性来计算。体外RBA的基本方法如下：1 .受体标本的制备在受体结合实验的研究中，所用的受体材料可以是组织切片、完整的单层培养细胞或游离活细胞、粗制或纯化的细胞膜受体、可溶性受体蛋白等。(1)冷冻组织切片明胶通常粘贴在载玻片上，与孵育缓冲液中标记的配体反应。反应后，可用缓冲液冲洗数次，切片厚度一般为5-50 m。组织切片的目的更多的是研究受体的分布(通过放射自显影或免疫组织化学)。(2)游离全细胞悬浮全活细胞可以是血细胞、培养的单层细胞、肿瘤的腹水细胞、处理过的原代细胞等。使用完整细胞的优点：1。受体在原始的正常环境中。膜不受干扰，膜中的酸碱度和离子梯度保持不变。受体及其相关的效应系统(如G蛋白)也保存完好。2.在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配体与受体的结合和细胞的生物学效应。所得结果能更好地反映受体的生理特性。3，可以直接给出每个细胞受体的平均数量。注意：对于完整细胞的受体分析，必须尽可能选择不易穿透细胞膜双层磷脂的标记物，否则由于游离配体进入细胞可能导致较大误差。此外，还必须注意防止手术过程中细胞表面生理活性的变化。例如，完整细胞的膜受体将在37进行受体内化，这将破坏结合反应的平衡状态并导致不正确的KD值。例如，80%的表皮生长因子受体将被内化，而4将阻止内化。(3)大多数受体的亚细胞组分RBA应通过差速离心法分为细胞膜、细胞质和细胞核，并取所需组分进行分析。其优点是：去除大部分外源蛋白和内源性配体，减少NSB或其他干扰因素；受体蛋白被初步浓缩，使得浓缩的受体制剂能够获得可靠的分析结果。亚细胞组分通常通过差速离心分离。通常先制备匀浆，然后在含0.25 0.3 mol/L的蔗糖缓冲液中用不同的离心力依次离心分离不同的亚细胞组分。在实验过程中，应注意以下几点：整个过程应在4下进行，以保证受体样品的结合活性；应严格控制缓冲溶液的蔗糖密度、离子强度、酸碱度和其他物质(如乙二胺四乙酸、Mg2+)对于任何受体系统，通常有几种标记配体可供选择。选择应从两个方面考虑：配体的特性；(2)实验的目的。(1)放射性配体的基本要求1。高比活度：通常，组织细胞中受体的浓度非常低，约为104-105个细胞，或0.01-1.0pmol/mg蛋白水平。低比活性配体难以满足分析灵敏度的要求。一般来说，比活性高于3.7