第三章理化检测食用菌粗蛋白杂质

可溶性糖类的检测(还原糖蔗糖总糖),(一)还原糖的测定,费林热滴定法(SP法)、铁氰化钾法（结合食用总糖检测时介绍）萨氏(Somogyi)法(费林法测糖)次碘酸钠法高锰酸钾法（二）蔗糖的测定蔗糖（无还原性）果糖+葡萄糖（还原性）物理法（三）总糖的测定非还原性糖酸水解还原性单糖按还原糖法测定,酸,本身存在的还原性单糖,（1）滴定必须在沸腾条件下进行不能把锥形瓶从热源上取下来滴定可以加快还原糖与的反应速度；保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝被氧化而增加耗糖量。（2）不能随意摇动锥形瓶以免空气进入反应液中，使亚甲基蓝被氧化,项目三产品理化指标检测,模块六食用菌产品其他理化指标检测技术,灰份总糖VC检测技术粗蛋白杂质,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法简便/须脱色、干扰多（深色、其他还原性物质）二甲苯二氯靛酚比色法深色荧光法：准确度高，较复杂2，4-二硝基苯肼法,还原型VC的测定,总VC的测定,总VC=氧化型VC+还原型VC+二酮古乐糖酸,少,氧化+还原+二酮古乐糖酸,操作复杂，结果易受影响,氧化型+还原型,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法1、原理VC的提取:用草酸/偏磷酸（不常用,需要在合适的PH下进行提取)将样品中的VC提取出来用蓝色的碱性染料标准溶液(2,6二氯靛酚标准溶液),对提取液进行氧化还原滴定根据消耗的染料的量可计算出样品中还原型VC的含量终点指示原理:染料被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法2、试剂（1）2,6二氯靛酚(2,6二氯靛酚吲哚酚钠盐)溶液,配制,碳酸氢钠,热蒸馏水溶解,加2，6二氯靛酚溶解,冷却后定容,过滤,保存备用,棕色瓶低温,滴定度的测定：每次使用均要进行该操作,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法2、试剂,1ml抗坏血酸标准溶液,10ml浸提剂,用2，6二氯靛酚溶液滴定,呈粉红色15s不褪色取10ml浸提剂做空白试验,（2%草酸OR2%偏磷酸）,CV滴定度T(mg/ml)V1V2,T每毫升2，6二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数C抗坏血酸的浓度,mg/mlV吸取抗坏血酸的体积,mV1滴定抗坏血酸溶液所用2，6二氯靛酚溶液的体积，mlV2滴定空白所用2，6二氯靛酚溶液的体积，ml。,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法2、试剂（2）抗坏血酸标准溶液(1mg/ml)称取100mg(准确至0.1mg)抗坏血酸，溶于浸提剂中并稀至100ml现配现用试剂发黄，则弃去不用,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法3、实验步骤(VC的提取/滴定/空白滴定),取样品,浸提剂,捣成匀浆,称取部分匀浆,浸提剂定容到100ml,过滤,滤液有颜色用白陶土脱色0.4g/g样品,取滤液10ml,2,6二氯靛酚溶液滴定,自身为指示剂浅红色酸式滴定管,空白实验：浸提剂10ml,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法3、实验步骤,(VV0)TA维生素C(mg/100g)-100W,V滴定样液时消耗染料溶液的体积，mlV0滴定空白时消耗染料溶液的体积，mlT2，6二氯靛酚染料滴定度，mg/mlA稀释倍数定容体积/吸取体积W样品重量，g,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法4、注意事项,（1）15秒钟红色不褪为终点样品中可能有其他杂质也能还原2，6-二氯靛酚，但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢（2）必须做空白实验,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法4、注意事项（3）样液制备时浆状物泡沫可能太多，可加数滴丁醇或辛醇（4）整个操作过程要迅速防止被VC氧化滴定过程一般不超过2min滴定所用的染料应在1-4ml之间（微量滴定管）如果太多？太小？选择合适的滴定管,滴定开始时，染料溶液要迅速加入，直至红色不立即消失,而后尽可能一滴一滴地加入（先快后慢）,VC检测技术2,6二氯靛酚滴定法4、注意事项（5）取样后，应浸泡在已知量的2%草酸溶液中2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用（防止被氧化）1%草酸无此作用,VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法1、原理用定过量的2,6二氯靛酚染料与试样中的维生素C进行氧化还原反应，多余的染料在酸性环境中呈红色用二甲苯萃取后比色，在一定范围内，吸光度与染料浓度呈线性相关，测剩余染料浓度，用差减法计算维生素C含量。2、仪器与试剂基本同二氯靛酚比色法/偏磷酸浸提,VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法2、实验步骤（1）样品处理定容到100ml（同二氯靛酚比色法）（2）测定30min内完成,食用菌中杂质检测,5ml2%偏磷酸和5mlpH4.0的乙酸钠缓冲液,6支试管/标准曲线（A500染料体积）,5ml2%偏磷酸样品浸出液,样品测定,不同体积2,6二氯靛酚溶液,10ml二甲苯,用力摇动,取有机层测A500,用力摇动,+5mlpH4.0的乙酸钠缓冲液+2ml染料溶液,用力摇动,VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法2、实验步骤（3）计算(2V)TA维生素C(mg/100g)100W,食用菌中杂质检测,2所用2,6二氯靛酚染料的体积，mlV查得2,6二氯靛酚溶液的体积，mlA稀释倍数T染料滴定度，mg/mlW样品重量，g,VC检测技术荧光法（氧化型VC+还原型VC）1、原理(1)偏磷酸提取样品中的VC(2)活性炭氧化提取液中的VC还原型VC氧化型VC样品中本来的氧化型VC喹喔啉（具有荧光性）荧光强度与氧化型VC的浓度在一定条件下成正比,食用菌中杂质检测,+邻苯二胺（OPDA）,VC检测技术荧光法（GB第一法）2、试剂（1）100g/ml抗坏血酸标准溶液先用偏磷酸-乙酸溶解并定容配成1mg/ml测pH,食用菌中杂质检测,2.2偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,2.2偏磷酸-乙酸,（2）活性C（活化）,活性C,1mol/L盐酸,加热回流1-2h,VC检测技术荧光法（GB第一法）2、试剂,食用菌中杂质检测,过滤水洗,烘箱中干燥,洗到洗液中无Fe3+,加入洗液,蓝色,检验：2%亚铁氯化钾+1%盐酸等量混合,洗液中有Fe3+,VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤（1）样品提取,食用菌中杂质检测,称取样品,偏磷酸-乙酸溶液,匀浆,取适量匀浆,含有1-2mgvc,调酸碱度,百里酚蓝指示剂,显红色（2.8）,偏磷酸-乙酸-硫酸定容到100ml,过滤,样品滤液,(2)用活性C氧化,VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤（2）氧化处理,食用菌中杂质检测,取样品滤液100ml,活性C,过滤,样品氧化液,振摇1mi,取抗坏血酸标准溶液100ml,标准氧化液,取滤液,最初几ml舍去,（3）制备试液（待测液）、标准液、空白液,VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤,食用菌中杂质检测,（3）制备试液（待测液）、标准液、空白液,5ml标准氧化液,5ml标准氧化液,标准液,标准空白液,5ml样品氧化液,5ml样品氧化液,试液（待测液）,试液空白液,5ml硼酸-乙酸钠,加水定容到25ml,摇动15min,5ml50%乙酸钠,加水定容到100ml,加水定容到25ml,加水定容到100ml,VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤,食用菌中杂质检测,（4）测荧光值,标准液,试液,标准空白液,试液空白液,各2ml,5ml邻苯二胺,避光放置35min,测荧光值（荧光分光光度计）,改为不同体积的标准液（0/0.5/1/1.5/2),标准曲线法,样品荧光值,标样荧光值,样品空白荧光值,标样空白荧光值,VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤,食用菌中杂质检测,（5）计算,I样品荧光值；Ib样品空白溶液荧光值；Is标样荧光值；Isb标样空白溶液荧光值c标样质量浓度，0.1mg/mL（100g/ml）；m样品的质量，g。D样品(测荧光值时)稀释倍数；5-5ml标准氧化液100-样品滤液100ml,VC检测技术荧光法（GB第一法）4、注意事项（1）尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C（2）不易过滤可改为抽滤或离心后取上清液过滤（3）活性炭用量应适当与准确（有吸附抗坏血酸的作用）（4）本法为外标法测定，也可通过标准曲线法测定（5）全部实验应避光操作（6）空白液中硼酸的加入消除产品中丙酮酸的干扰,食用菌中杂质检测,VC检测技术2，4-二硝基苯肼法（GB第二法）1、原理样品中还原型VC经活性炭氧化为氧化型VC原有的氧化型VC脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。,食用菌中杂质检测,2，4-二硝基苯肼,红色脎,VC检测技术2，4-二硝基苯肼法（GB第二法）2、实验步骤（1）样品提取同前法（2）氧化取25ml样品滤液2g活性C振摇1min过滤取滤液10ml10ml2%硫脲溶液样品氧化液（3）呈色反应,食用菌中杂质检测,最初滤液舍去,4ml氧化液,4ml氧化液,4ml氧化液,空白,平行实验,2，4二硝基苯肼,373h,防止VC继续被氧化促进脎的形成,氧化剂+脱色剂,VC检测技术2，4-二硝基苯肼法（GB第二法）2、实验步骤,食用菌中杂质检测,冷却,空白液室温,样品液冰水,冰水冷却,2，4二硝基苯肼,10-15min后,（4）85%硫酸处理,本步已成脎，但显色不稳定用浓硫酸处理，转变为橘红色的双-2，4-二硝基苯,每支+5ml85%硫酸,边加边摇至少加1min,室温下放置30min,VC检测技术2，4-二硝基苯肼法（GB第二法）2、实验步骤,食用菌中杂质检测,（5）比色测定测A500,（6）绘制标准曲线50ml1mg/ml抗坏血酸标准溶液1g活性C振摇1min过滤取滤液10ml5g硫脲1%草酸定容到500ml（浓度为20g/ml）1%硫脲稀释到不同浓度（1/2/4/6/10/12g/ml）以下操作同样品测定取4ml2，4二硝基苯肼373h5ml85%硫酸室温下放置30minA500标准曲线,VC检测技术2，4-二硝基苯肼法（GB第二法）2、实验步骤,食用菌中杂质检测,（7）计算,X=（cV/m）F(100/1000),X样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；c由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，g/ml；m试样质量，g；F样品氧化处理时的稀释倍数；V呈色反应所用试样体积，ml。,VC检测技术2，4-二硝基苯肼法（GB第二法）3、注意事项（1）试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。（2）活性C氧化剂+脱色剂（深色样品）无色或已脱色样品溴或2，6二氯靛酚作氧化剂（3）硫脲的加入防止VC继续被氧化促进脎的形成,食用菌中杂质检测,食用菌中蛋白质检测,测定蛋白质的方法可分为两大类利用蛋白质的共性，即含氮量（16%）、肽键测定蛋白质含量；利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法,凯氏定氮法,水杨酸比色法、紫外分光光度法、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法、红外光谱,蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法,食用菌中蛋白质检测,凯氏定氮法,测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数（1/16%）而求出蛋白质的含量为粗蛋白含量（含有少部分含N非蛋白核酸、生物碱等）,1833年Kieldahl首先提出,常量K氏定N法,微量K氏定N法,自动K氏定N法,半微量K氏定N法、改良法等,食用菌中蛋白质检测,1、原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出有机氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵,常量K氏定N法,硫酸铜作催化剂常量、微量、半微量硫酸铜+二氧化钛改良,2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O,食用菌中蛋白质检测,1、原理,常量K氏定N法,加硫酸铜,催化剂,指示消化终点：溶液为蓝绿色（硫酸铜溶液颜色），清澈透明,加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度,蒸馏时碱性反应的指示剂（判断加碱量是否足够）,C+CuSO4Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H20+SO2,蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色而不成褐色（氢氧化铜沉淀、CUO沉淀、铜离子与氨的络合物），此时需再增加氢氧化钠用量。,食用菌中蛋白质检测,常量K氏定N法,2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O,消化,一定是浓硫酸：,浓硫酸具有脱水性,使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮,浓硫酸又具有氧化性,2H2SO4C2SO22H2OCO2,二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫,H2SO42NH3(NH4)2SO4,加硫酸钾,增温剂，提高溶液沸点（330400）,浓硫酸酸性,食用菌中蛋白质检测,1、原理用硼酸吸收氨以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。,常量K氏定N法,整个过程：消化、碱化、蒸馏、吸收、滴定,2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O,(NH4)2B407+H2S04+5H20(NH4)2SO4+4H2BO2,加碱蒸馏，使氨蒸出,(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4,食用菌中蛋白质检测,2、仪器与试剂（1）通风橱（2）消化装置（3）蒸馏装置（4）盐（硫）酸标准溶液配制、标定（5）奈氏试剂Nessler试剂，K2（HgI4）,常量K氏定N法,3.5gKI+1.3gHgCl2溶于70毫升水。加30毫升4mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。,溶解11.5gHgI2+KI10g于适量少许水，后加水稀释至50ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。,食用菌中蛋白质检测,3、实验步骤（1）消化,常量K氏定N法,5克样品+10克结晶硫酸钾+l克硫酸铜+浓硫酸25毫升,小火加热,保持和缓的沸腾使火力集中在凯氏瓶底部（以免溅附在壁上的蛋白质处于无硫酸存在的情况，使氮有损失。）,液体为蓝绿色透明,继续加热微沸1h,冷却,样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上.(用水冲洗)消化时如不呈透明溶液，可放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下促进其消化完全,食用菌中蛋白质检测,3、实验步骤（2）蒸馏、吸收,常量K氏定N法,B25毫升硼酸吸收液甲基红溴甲酚绿混合指示剂下端插入液面下40（可放在冷水浴中）,A少量水、消化液、玻璃球,C80毫升50%氢氧化钠溶液,D加热蒸馏,将全部氨蒸出:估计时间1-2h奈氏试剂检查是否蒸完PH试纸检查冷凝管下端用水冲洗后继续蒸馏1min后关闭热源（防止倒吸）,检验NH4+离子，遇铵根离子析出黄色或红棕色沉淀,食用菌中蛋白质检测,3、实验步骤（3）滴定,常量K氏定N法,馏出液,标准盐酸溶液滴定,甲基红溴甲酚绿混合指示剂蓝色微红色,别忘记做空白实验！不称样消化蒸馏吸收滴定,食用菌中蛋白质检测,3、实验步骤（4）计算,常量K氏定N法,C(V1-V)X0.014总氮()=X100W,C盐酸标准溶液的摩尔浓度；V1样液滴定消耗的盐酸标准溶液的量(毫升)；V空白滴定消耗的盐酸标准溶液的量(毫升)；W样品重量(克)；0.014氮的毫摩尔,粗蛋白质()=总氮()K,K换算系数，食用菌产品等于4.38,食用菌中蛋白质检测,4、注意事项（1）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。（2）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。（3）消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。,常量K氏定N法,食用菌中蛋白质检测,（4）蒸馏装置不能漏气（5）各种试剂及装置的作用及影响浓H2SO4脱水炭化(生成CHN)、氧化、与NH3作用CuSO4催化剂、指示剂（消化、蒸馏前加碱）K2SO4提高沸点有时加入硒粉、氧化汞催化剂（为了防止污染通常采用硫酸铜）50%NaOH的作用：释放铵盐中的NH3。,常量K氏定N法,食用菌中蛋白质检测,K氏烧瓶和取样量1g以上的样品，K氏烧瓶最小500ml（加热均匀缩短消化时间）H2SO4和K2SO4的添加量(一般指导原则)1g样品K2SO4：H2SO4=7g：12ml若取样量较大，如干试样5g可按每克试样5m1的比例增加硫酸用量。吸收液标准H2SO4溶液：用标准碱返滴定，甲醛(基)红指示剂硼酸：用HCl进行滴定，混合指示剂蒸馏常量法直接蒸馏微量法水蒸汽蒸馏,常量K氏定N法,不需要精确知道体积不需要标定浓度弱酸对酸碱滴定要求低,食用菌中蛋白质检测,微量K氏定N法,原理及适用范围同前与常量法不同点样品质量、试剂量变少微量滴定管微量凯氏定氮装置（水蒸气蒸馏）,实验操作（1）消化最后加水定容到100ml,其他与常量法一样（2）蒸馏,食用菌中蛋白质检测,微量K氏定N法,（1）按图安装好微量定氮蒸馏装置,（2）装水2/3甲基橙、硫酸数ml（保持酸性）,（3）10ml4%硼酸2滴混合指示剂,（4）10.00ml样品消化稀释液（5）少量水冲洗（6）10ml10%氢氧化钠（7）少量蒸馏水冲洗，盖塞,（8）加热蒸馏吸收液变为绿色计时蒸馏10min冷凝管提离液面继续蒸馏1min（9）滴定,食用菌中蛋白质检测,自动K氏定N法,1、原理及适用范围同前2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，数分钟完成1个样。,食用菌中蛋白质检测,1、原理(标准曲线法)样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液在一定的酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物在波