浙江大学生物化学实验甲 奥赛-质粒DNA的小批量提取与酶切鉴定.ppt

质粒DNA的提取与酶切鉴定,（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定1、质粒简介质粒是一种寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小为1kb200kb之间，具有自主复制和转录的能力，但其复制和转录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质。2、分离纯化质粒的原理分离纯化质粒DNA主要是利用宿主细菌DNA与质粒DNA之间的差异来进行的。,（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定,细菌DNA与质粒DNA形状上均为双链环形，但二者的分子量相差较大，细菌DNA的分子量在109D左右，而质粒DNA的分子量仅为106107D，提取纯化质粒的过程中，细菌DNA大多断裂成线状分子，而质粒DNA则多数仍为双链环状，从而即可将二者分开。本试验采用微量碱变性法来分离纯化质粒DNA，具体的分离纯化原理如下：,0,细菌（含质粒）,溶菌酶（震荡）,破细胞壁,SDSNaOH,（细菌DNA和质粒DNA均通过碱变性成为线状分子）,破细胞膜,冰醋酸,细菌DNA与变性蛋白和细胞碎片缠绕在一起（不能复性）质粒DNA经复性后变为共价闭合环状,离心,沉淀：细菌DNA、细胞碎片等上清：质粒DNA、RNA、可溶性蛋白等,酚：氯仿离心,下层：酚，氯仿中层：变性蛋白上清（水层）：质粒DNA、RNA等,无水乙醇离心,上清：可溶性杂质等沉淀：质粒DNA、RNA等,RNase,质粒DNA,（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定,质粒DNA的天然结构为共价闭环（超螺旋）结构，但在制备过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA的分子可能呈现出如下几种构型：超螺旋型（共价闭环）质粒DNA：（cccDNA）超螺旋状。开环质粒DNA：（ocDNA）质粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，从而形成松弛的环状分子。线状质粒DNA：（linearDNA）质粒DNA的两条链在同一处断裂，从而变为线状分子。见图1,（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定,电泳时，由于分子形状的不同，三种质粒DNA的泳动行为不同，根据电泳迁移率从小到大的顺序分别为开环质粒DNA、线状质粒DNA和超螺旋质粒DNA。3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。,（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定,电泳中所使用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp50kb的DNA片断，通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭（EB），在紫外光下即可检测出10ng的DNA条带。当用琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA样品时，根据条带的位置即可知道质粒DNA的三种构型及其比例。,（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定,此外，还可了解质粒样品中的杂质，如RNA、染色体DNA、蛋白质等的污染程度。电泳时如用已知分子量的核酸作对照，还可测定样品核酸的分子量。4、材料与试剂、试验材料本实验所用质粒为重组的pBSKS质粒。其中质粒pBSKS来源于大肠杆菌，其物理图谱见图1.2。,（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定,经在BamH和Hind切点间连接上一个大小为1.7kb的片段，即成为重组的pBSKS质粒。见图1.3。、试验试剂试验试剂及使用时的注意事项解说详见P144及P147。标准核酸的分子量见图1.4。5、操作步骤、质粒的提取,（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定,质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。、电泳鉴定胶浓度：0.70.8%上样量：5ul质粒+1ul上样缓冲液各步操作方法及注意事项解说详见P148。6、实验结果及处理仔细观察纯化过程中各步试验现象。仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,1、限制性内切酶简介限制性内切酶或限制性核酸内切酶（RestrictionEnzymeorRestrictionEndonuclease）是指能辨认双链DNA分子中的特异碱基序列，并在此序列处以内切方式将DNA双链同时切断的一类酶。根据它们的作用特点，可将其分为三类：类和类酶，在同一种酶分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用，类酶由于切割位点随机，类酶则由于切割位点不对称，因此这两类酶的作用都不大。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,类酶由两种酶组成，一种为限制性核酸内切酶，另一种为独立的甲基化酶。其中，对我们最为有用的是类酶中的限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物中，1970年由H.O.Smith等从流感嗜血菌中最先分离得到。现已发现近几百种(498种)。该类酶能识别DNA分子中的特异序列，并在此序列处切断DNA双链。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,绝大多数限制性内切酶的识别序列为4个6个碱基对，该序列具回文对称结构，且富含GC。（即旋转1800后与原来结构相同），少数酶可识别更长的序列或兼并序列。限制性内切酶切割后的DNA片断，有的产生粘性末端，有的产生平末端。如：、产生粘末端的酶,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,BamH：GGATCCHind：AAGCTTCCTAGGTTCGAA两条链的断裂位置是交错地担又对称地围绕着一个对称轴排列。、产生平末端的酶：Hae：GGCCCCGG两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心。常用限制性内切酶的酶切位点可参见有关书藉。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,限制性内切酶由于能识别特异顺序并进行切割，因而在基因重组、序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱的绘制等技术中被广泛应用。2、重组质粒pBSKS的酶切图谱重组质粒pBSKS的酶切图谱见图1.5。、由图可见，实验所用的BamH和Hind在质粒pBSKS上均为单切点的限制性内切酶，、pBSKS经这两种酶切割后可产生大小二片段，大片段为2.96kb，小片段为1.7kb。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,如为完全酶切，电泳后应产生这两个片段的电泳图谱，由此即可对提取的质粒进行鉴定。3、操作方法（1）、酶切反应体系,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,加样顺序：水-缓冲液-DNA-酶，酶总是最后才加入到反应体系中。各组分加完后可轻弹管壁，使混合均匀，并用离心机短暂离心至管底。切忌振荡混匀！（2）、酶切条件将离心管置于37保温2h，使酶切完全，备用。（3）、电泳鉴定胶浓度：0.81.0%上样量：10ul质粒+2ul上样缓冲液各步操作方法及注意事项解说详见P148-P149。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,4、实验结果及处理仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。注意与未经酶切的质粒的电泳图谱相比较。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,5、单酶切反应标准体系的建立在建立酶切反应体系时主要需考虑两个关键因素：加入的DNA量和酶量。根据定义，在50l体系中，1单位的限制性内切酶即可在60分钟内完全切割1g的底物DNA。但是，目前大多使用510倍量的过量酶来切割DNA，以利于克服由于DNA来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败。1、一般的反应体系如下：,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,2、反应条件反应时间：12小时，一般1.5小时。可加入过量的酶以缩短反应时间。对于许多酶，都可以用更少单位的酶消化16小时。反应温度：一般37，但应注意因酶而异。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,3、终止反应若消化后的DNA不需要进行后续的实验操作，可用终止液终止反应（50%甘油、50mMEDTA（pH8.0）和0.05%溴酚蓝）。按每50l反应体系中加入10l的比例进行。若消化后的DNA需要进行后续的实验操作，可用热失活法终止（65或85保温2030分钟）。也可利用商业化的离心柱或酚/氯仿抽提去除内切酶。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,6、影响限制性酶切反应的因素DNA纯度、缓冲液、温度及限制酶本身都会影响酶的活性。1、DNA纯度待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA样品中蛋白含量过高、高浓度的RNA等对酶切均有影响。酶切体系中DNA浓度过高也会导致酶切失败。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,另外，应注意甲基化的DNA会抑制某些酶的切割效率。2、内切酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。为避免污染，每次吸取酶时都需用新的吸管头。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应加好并已预混合）。加入的酶量在底物（DNA）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,但如酶量超过反应体系的10时，会造成体系中甘油过量（因酶的储存液中含有50的甘油），而使酶产生Star活性。因此，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10，在能切开的条件下越少越好。3、缓冲液每一种酶厂家都提供有相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。有的酶要求100g/ml的BSA以实现最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,按盐离子浓度缓冲液可分为三大类：高盐、中盐和低盐。每种酶都有自己的盐浓度需求。缓冲液配制为10的母液，酶切时需稀释10倍。常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，联合酶切时，可根据厂商提供的联合酶切的缓冲液选择表选择缓冲液或采用万能缓冲液。4、混合这是非常重要然而常常被忽略的一步，想要反应完全，必须使反应液充分混合。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,推荐用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！5、反应温度常规酶切反应均在37进行但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30，故最好根据所选用的酶确定反应温度。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切。6、反应时间常规酶切反应时间为1.5小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长23小时，有时甚至可以过夜。一般来说，在DNA量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切DNA时，可以考虑酶切过夜。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,7、双酶切的解决方法在DNA重组实验中，经常会用双酶切（甚至是3个酶切鉴定）鉴定重组子或获得不同粘性末端的DNA片段，应注意，如采用两种限制酶进行切割，则必须分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，待调节盐浓度后，再用高盐浓度的限制酶水解。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,也可在第一个酶切反应完成后，将第一个酶变性除去后再进行第二个酶切反应。应注意厂商提供的联合酶切缓冲液中并不包括所有类型的酶，即使提供了“万能缓冲液”，有些酶的联合酶切也不一定能取得比较好的效果。通用的解决方法有两种：,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,（1）分步酶切法即先选择一个酶，采用此酶的最佳反应条件进行酶切，酶切完全的DNA进行沉淀后再溶解，然后选用第二个酶进行最佳反应。在酶切时，一般选择便宜的酶进行酶切沉淀，而后再进行第二个酶的酶切反应。此方法通用性较强，联合酶切也比较完全，但较耗时，而且DNA再沉淀后有部分损失，要求开始时DNA的投入量要比较高。,（二）、质粒DNA的酶切鉴定,（2）同步酶切法取两种酶的最佳缓冲液各50加入到酶切反应体系中，并同时加入两种酶进行反应。特别是对不同厂商提供的酶进行联合酶切时，即可节约时间也可取得比较好的酶切效果。8、酶切失败的原因及处理办法酶切失败主要表现为两方面：（1）不完全酶切甚至是DNA基本未发生酶切。主要原因有：