微卫星DNAppt课件

微卫星DNA,1,一、微卫星的概况,1、定义短串联重复(shorttandemrepeat,STR,SSR)，一种简单串联重复DNA序列。其重复单位为16个核苷酸，由1050个重复单位串联组成。微卫星DNA是在研究DNA多态性标记过程中发现的。1981年Miesfeld等首次发现微卫星DNA，双核苷酸重复单位常为(CA)n和(TG)n。,2,2、STR的构成,STR的核心序列为16bp,呈串联重复排列,重复次数1050次左右,其总长度常小于400bp,常见的有一、二、三、四核苷酸重复序列,约占真核生物基因组的5%。人类基因组的STR单核苷酸重复以polyA,polyT多见,双核苷酸重复以(CA)n,(GT)n,(AA)n,(GG)n常见,(GC/CG)少见,其原因是由于3”端为G的C(即CPG)易于甲基化,三核苷酸重复以(CXG)n类型常见,由于三核苷酸具有高度多态性,常用作DNA的标记物。,3,每个特定位点的STR均由2部分构成:中间的核心区和外围的侧翼区,核心区含有一个以上称为”重复”的短序列,一般该重复单位的碱基对数目不变,而串联在一起的重复单位数目是随机改变的。位于核心区的外围即是侧翼区,人群中不同个体可表现为侧翼区相同而串联重复单位的数目不同;也可为相同数目的重复单位,但侧翼区大小不同,或者两者均不同。STR位点的侧翼区变异数也仅有少数几个,这样,人群中该特定STR位点的等位基因差异,主要应来自不同数目的串联重复。,4,2STR的分布,在基因组中平均50kb就有一个重复序列。据GeneBank等数据库资料统计,人类23对染色体上至少分布着7901个STR位点,每对染色体的STR位点分别超过100个,其中1、2号染色体的位点均超过600个,性染色体上的已知位点数在264个以上,随着人们对STR的进一步研究,其数目还会不断增加。,5,3STR的种属特异性,1995年有学者调查了9个STR的人种属特异性,结果在被调查的23种动物中,FES/FPS基因座没有扩增产物,而CSF1PO、TOX、TH01、HPRTB、vWA、F13A01等基因座则在灵长类有扩增产物,但是这些扩增产物的长度均位于这些基因座的STR的等位基因Ladder范围之外。此后对更多STR基因座的调查也得到了相似的结论。,6,4STR产生的可能机制,目前认为链滑动错配是短串联重复序列突变的主要机制。在DNA合成过程中,一条单链DNA可以发生一过性的脱位,生成一个中间性的结构后,再与另一DNA单链错配,形成链滑动错配,继续DNA的复制和修复。滑动错配可以造成缺失、插入或碱基替换。,7,在STR中,一条DNA单链可以向后折叠后再与另一条单链复性,在复性的位置形成环状突出,DNA修复酶可以将环状突出全部或部分切除,造成缺失。另一方面,也可以在无突出链相对突出的位置形成一个缺口,再由聚合酶填补此缺口,DNA重复的数目增加,造成插入突变。STR长度上的差异一般是重复单位的整数。复制滑动、姐妹染色体不等交换和遗传重组都是可导致重复单位数目发生改变的机制,但目前的研究证明复制滑动时导致STR重复数目改变是主要机制。,8,不过,仅滑动链复制错配不能解释一些重复序列的特征,如为什么两性种系的三体重复稳定性有差异?为什么CAG重复总在有意义链上等等?所以,对STR产生和拷贝数的变异的遗传机制解释还有滚环扩增、不等交换(unequalcrossover)和碱基置换突变等。,9,5STR的特点,种类多、分布广，并按孟德尔共显性方式在人群中世代相传。在人群中高度多态，其多态信息含量容量超过70%。其多态性表现为正常人群的不同个体某一基因位点重复序列的重复次数可不一样，同一个体的两个同源染色体上重复次数也可以不一样，即微卫星DNA拷贝数在人群中是可变的。,10,具有遗传连锁不平衡现象。可被转录，有些编码蛋白质，而另一些则位于非转译区的5端和3端不编码蛋白质。属于不稳定的DNA序列，其数目在某些遗传病中有扩大现象，而这种扩增并非是减数分裂的重组造成，扩大可发生在减数分裂过程中，由一代传递给另一代，也可发生在有丝分裂中，导致嵌合体形成。与成熟人体细胞比较，微卫星DNA在胚胎时期有丝分裂很不稳定。在不同基因位点上的微卫星DNA的重复序列可以不同，也可以相同。,11,二、微卫星的应用,1、STR应用于制作人类基因组遗传图谱STR在基因组内分布广泛、多态性程度高、可自动化检测、成为制作基因组遗传图谱的首选遗传标记。1996年,法国Gene-thon实验室与美国国家卫生研究院几个中心合作,建立了以6000多个STR为主体遗传标记、分辨率达194kb的高精密度图谱。STR的出现使遗传图的精度得到进一步提高,同时也成为物理图上的标记,从而促进了遗传图与物理图的融合。,12,2STR用于个体识别和亲权鉴定因为STR广泛存在于基因组中,具有高度多态性、杂合性和稳定性。当把几个STR位点联合分析后,可以得到相当高的累积个体识别率和父权排除率。对粤、桂、琼地区14个人群STR基因座频率调查显示15个STR基因座在14个人群中累积个体识别能力在1.05*10-163.18*10-18,累积非父排除率均在0.9999以上。,13,3STR用于遗传学多态性研究STR标记多位于非编码区,变异一般不影响人体的结构与功能,突变在进化过程中受自然选择压力较小,以近乎稳定的速率传递且不断积累,形成多样性。通过研究STR多态性,变异速率以及比较序列间差异、人群间差异,分析不同人群间的遗传距离,就可从分子生物学角度揭示人类的起源、迁徙、进化等历史进程。,14,目前,根据mDtNA、STR标记、Y染色体DNA以及多态性AluI序列的研究,大多数分子遗传学家支持现代人类单起源学说,认为现代人类起源于20万年前的非洲原始部落,然后向世界各地迁徙。但也有学者支持现代人类多起源,认为除非洲外,亚洲、欧洲也可能是人类发源地。,15,4STR在疾病诊断和治疗中的应用4.1STR与遗传病的诊断近年来,发现基因内外的一些STR与遗传病的发病有关,目前报道较多的疾病有7种遗传病与三核苷酸重复片段扩增突变有关:脆性X综合征、脊髓延髓肌肉萎缩、强直性肌营养不良、Huntington舞蹈征、脊髓小脑共济失调型、FRAXE轻度智力低下和齿状核苍白球丘脑下部萎缩。,16,在脆性X综合征中,FMR1gene中的(CGG)顺序在正常人中的重复次数少于60次,携带者60100次,而发病者则多于100次。现在,STR越来越多用于研究多基因病,如采用STR对型糖尿病进行全基因组扫描,发现12个位点与该疾病高度相关,其中包括HLA22抗原位点,更多的人开始用STR方法对高血压、哮喘和型糖尿病进行了研究。,17,4.2STR与肿瘤的诊断微卫星DNA由于复制错误引起简单重复序列改变,常产生微卫星不稳定性(MSI),表现为肿瘤组织与其相应非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变,它在胃肠道肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色,可能是肿瘤发生的一种新机制。,18,MSI首先在结直肠癌中观察到,1993年,在研究遗传性非息肉大肠癌中观察到多条染色体均有短的核苷酸重复序列(CA)n的增加或丢失,提示MSI散布于整个基因组中,后来陆续在子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌、食管癌以及慢性髓细胞性白血病中都出现MSI,人们认为MSI可能在肿瘤基因调控中起重要作用,参与肿瘤的发生和发展,这种基因水平的改变常先于表型的改变,通过MSI的检测有助于早期发现某些肿瘤及对高危人群进行早期防治。,19,4.3STR用于器官移植对器官移植后植入状态的检测,对了解受者治疗疗效、指导医生用药、预后估测等更是有重要意义。STR作为骨髓移植后供者细胞植活的证据是很客观的:供者细胞植活后,受者外周血出现供者的STR类型,而受者口腔黏膜细胞仍为原来类型。因此,可以长期观察供者细胞在受者体内存活情况。,20,5STR适合于降解、微量检材的检测STR的扩增片段大多在400bp以下,PCR扩增容易成功,适用于降解检材的检验。灵敏度也高于VNTR,达到ng级。实验已经证明,实验室条件下,或模拟的各种环境条件下,各种斑痕,如血痕、精斑、阴道液斑,甚至是自然条件下的骨头,在数十年后