浅谈石蜡切片的制作与存在问题

浅谈石蜡切片的制备及存在的问题摘要：石蜡切片是观察植物组织结构的常用制备方法之一。 活细胞和组织多为无色透明，各种组织之间和细胞内各种结构之间缺乏对比度，一般光镜难以区别的组织离开机体后即死亡，组织发生腐败，失去原来的正常结构，观察植物叶片结构，结果发现组织固定、石蜡包埋、切片、染色等步骤关键词：石蜡切片组织染色； 形态结构石蜡切片(paraffin section )石蜡切片又称永久切片，是组织学上应用最广泛的常规切片技术方法。 其优点主要适用于各种植物组织的电影制作，切片厚度容易控制(最薄可达015m )，清晰度好，适用于细胞学研究，可制作连续切片，电影制作容易长期保存，交流方便等。 但是，制作周期长，容易受条件制约，制作中使用的化学药品多，容易被人污染，材料容易变脆、变硬、变形，某些内容物容易消失，组织变小、组织扭曲、变形，细胞中含有的物质变小，折射性变强一、植物组织制作技术概述植物组织制作技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，是认识植物结构的有效手段，是植物生物学的重要组成部分1 . 切片技术是生物科学家尤其是植物学家常用的实验手段。 随着各种新设备的出台和新技术方法的建立和使用，石蜡切片技术也逐渐扩大，渗透到许多新领域，为基础技术提供了有效的实验和样品。 石蜡包埋组织切片还可应用于细胞原位核酸分子杂交技术，材料中杂交的DNA分子定位、含量分析和基因表达(mRNA )水平观察的聚合酶链反应(PCR )技术固定，可应用于石蜡包埋组织的DNA分析，研究进入了分子水平，但在短期内这些技术仍通常迄今为止，植物制作技术已经建立了很多方法，多采用的有徒手切片法、滑片法、分离法、打片法、石蜡切片法等3，其中最常用的是石蜡切片法。 但是，通常的石蜡切片法包埋和染色所需的时间太长，很麻烦，也不能使用硬材质的材料。 本研究也采用该方法，对方法进行了一些改进，其周期短是该方法的显着特点，8-10天即可完成整个制作工艺，同时节省了试剂6。二、实验仪器和试剂2.1器具石蜡切片机、烤箱、切片机、恒温展台、蜡杯、玻璃杯、酒精灯、蜡刀片、显微镜、染色缸、培养皿、镊子、砧木、橡胶、洗脸盆、包装托盘、吸管、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。2.2试剂1%番红、1%固绿、各浓度的酒精(无水乙醇、95%、85%、80% )，70%、50%、30% )、FAA固定液、二甲苯、石蜡、埃立昔康精液、卡普特粘片剂、蒸馏水、中性胶等。3实验材料选择植物健康、标准和代表性部分4。 不是为了特别的目的，就不能使用病态异常的材料。 采集的材料应尽快浸泡在固定液中固定。 本实验采用几种针叶树(Stipa.)叶片制作石蜡片，材料直径约1mm，长度为0.8-1.0cm。4实验步骤4.1固定切断的材料应及时投入固定液。 选择固定液的原则是用药物杀死细胞，凝固细胞的原生质体，尽量保持原来的结构，以免死后发生变化。 良好的固定剂渗透力强，能迅速使细胞死亡，原生质体全部凝固，没有任何变形，也没有提高折射率，不妨碍染色。 因此，植物材料不同，必须选择不同的固定液。 我们选择FAA固定液来固定针叶树的叶子。 FAA固定液是最常用的固定液，其用量至少是固定材料总体积的20倍，能够在植物材料周围浸泡在固定液中，使固定液在短时间内渗透到材料中。 植物材料固定后，如不及时制作，可保存在固定液中或70%酒精溶液中7 .4.2脱水和透明度从固定液中取出材料后，进行植物材料脱水，具体流程如下a :酒精x :二甲苯70 % a (2h )70 % a (2h )70 % a (2h )80 % a (一夜)85%A(2h)95%A伊红(2h )100 % a (1h )100 % a (1h )1/2 a1/2x (1h )1/2 a1/2x (1h )x (1h )x (1h )。 设置浓度梯度是为了防止材料的皱纹，但具体的浓度梯度和浸渍时间因材料的情况而异，年轻材料的梯度大，各阶段的浸渍时间短，老的硬梯度小，各阶段的浸渍时间长。 第二次百分之百a脱水很重要，必须防止水泄漏。4.3蜡的渗透用镊子将透明材料取出到蜡杯中，将碎石蜡(熔点48-50)用蜡铲子放置到蜡杯的2/3，盖上盖子放入37的烤箱中，放置24小时使蜡融化。 24小时后取下蜡杯盖，然后将烘箱温度调至56，放置5天，使透明剂充分挥发。 拿几杯，把材料转移到加了熔点为6062的石蜡的杯子中，使烘箱温度为70，把熔点为6062的石蜡变成2h，换3次就进入包装程序。4.4包埋4.4.1折叠包装箱包埋前请准备好包埋用的盒子。 纸箱用硬光滑的纸折叠，大小取决于植物材料的大小。 这里使用6cm1cm的纸箱。4.4.2植物材料包埋将纯石蜡放入小箱中，用加热的镊子将材料与必要的切面以一定间隔整齐排列，垂直包埋5。 稍微凝固后，倒向清水盆，完全冷却凝固。 通常石蜡包埋最困难的是小组织，细叶包埋，箱子里可以装少量的石蜡，固定材料的基部后，倒到完全复盖石蜡。4.5修理蜡从卖包埋材料的箱子里拉出蜡块，用两面的刀刃切成小块，刀刃不要太厚，以免材料从蜡块上脱落。 每个小块都含有材料，呈梯形，梯形的上部有切断面。 注意上部矩形对边平行，梯形底部用热水器固定在木台(2cm2.53cm )上，植物材料切断面与木台粘贴面平行。4.6切片将带蜡的小木块固定在切片机上，调整切割距离至适当大小，转动调节器将切片厚度调整至8m进行切片。 注意切片的时候，一只手转动切片机，另一只手拿笔把剪下的电影展开，形成长的蜡带。 切片过程中，如果蜡偏向一侧，则蜡块也必须立即修正，确保切片的连续性。4.7粘合片和烘烤片将一滴粘合片滴入干净的载玻片中央，用干净的标签纸均匀涂抹后，滴入蒸馏水，将取下的代表性蜡带剪短放在载玻片上(45段)，然后将载玻片放在恒温展示台上(40)热片。 充分熨烫后，把转移到边缘试验玻璃板上的水分充分干燥。 之后，将切片放置15天自然干燥，或者在31的烤箱中干燥一天。 熨烫时要把握时间，注意不要烫得过度。 但是，请充分熨平。4.8蜡的脱除与染色将玻璃片标本放入切片框中脱去染色工序。 具体的顺序如下：例如过度)85%A (过度)50%A (过度)30%A (过度)1%番茄溶液(4h)蒸馏水(速度)50%A HCI (速度)95%A氨水(速度)1%固绿(95%A调制) (30s)95%A (1min)100%A (过度)100%A (过度) 50%X 50%A (过度)100%X (过度)100%X番红的染色时间要注意长(至少3h以上)，此后缩短2次酒精的通过时间，以免洗掉染色的番红，固绿的染色时间约为20-30s，必须视情况而定。4.9密封从二甲苯中取出好色电影，用中性橡胶密封。 酱油植物切片的玻璃板放在实验台上，玻璃板中央垂下橡胶，慢慢伸出外面，用镊子干燥，或取出浸入75%乙醇中的玻璃盖，从植物切片一侧倾斜接触橡胶，玻璃盖内表面整体接触橡胶后，用镊子擦干密封用的这个玻璃板很清洁，密封时请注意不要产生气泡。三、石蜡切片制作中的问题及解决石蜡切片是目前各种切片制备方法中最常用的方法。 优质切片标准是切片平整，无切口，无伤痕，无皱纹，染色鲜明，清晰，红蓝对照清晰。 但是，制作石蜡切片的工艺多，步骤复杂，无论在哪个阶段发生问题，都会影响整个切片的质量。 影响切片质量的因素多为：1、脱水脱水过程中出现的问题主要是脱水污垢和过度硬化，脱水污垢时二甲苯无法侵入，蜡液无法侵入组织，切片困难，切出的电影在染色时容易脱锁。 组织蜡块即使与空气接触，水分也会蒸发下沉，脱水时必须保证脱水液的浓度符合标准。 常换新液，遇到脂肪组织和稀疏纤维组织需要延长脱水时间。 组织在纯洁的精加工中放置的时间也不长。 不那样的话，会导致过度的硬化。 另外，为了防止组织过硬，在比较柔软的组织中，其最初的脱水加工浓度可以低于70 % (8)。2 .透明二甲苯是最常见的透明剂，但收缩性强，容易使组织变脆，在此过程中必须严格控制。 一般30分钟就能达到透明度，但温度低的情况下可以适当延长时间，或者放入温箱加热。 还要注意在透明过程中更换二甲苯，有时也要更换二三次以上，每次二甲苯为旧液体10分钟左右，必须选择更换次数多。3、浸蜡，包埋蜡浸渍和包埋必须一次性完成。 应尽量在恒温下操作，防止中间出现温差。 蜡的温度适当，不得使组织变热、变小、组织变脆、变硬、温度降低而使组织与石蜡脱离。 蜡块上不会出现气泡、裂缝和斑点。 要尽量使小组织处于同一平面。 否则，切片可能完全缺失或缺失。 在这种情况下，必须尽可能小地使组织下沉，防止重叠。4、切片手工切片时，力必须均匀。 不过强的话，切片的厚度会变得不均匀，甚至会破坏蜡块。 在夏季切片中，为了保持蜡块的硬度，将蜡块放入冷冻库中，切割时可以取出，组织蜡块的周围应在切片前调整，大小适当，切片机稳定，不振动，切片刀放置，倾斜角适当，通常为203095、染色在染色过程中多出现，除了要防止染色效果不好以外，还要注意不能脱水。 因此首先要注意染色液的制备浓度正确，PH值适当，无沉淀。 染色前的切片要彻底脱落。 染色时间根据染液的新旧适当调整，根据需要在染色过程中用显微镜观察，使染色过程中不受阳光照射。 防脱片的主要措施是清洗：玻璃片，贴片时水温充足，切片与切片紧密接触，贴片后不应立即染色晾干。 染色过程中，水洗不要太激烈。6 .密封易出现切片封堵不良、色素颗粒、气泡、云雾状物等的原因是：封堵时二甲苯挥发、封堵剂薄、切片薄、切片不展宽、封堵方法不当、组织未脱水等，因此封堵前二甲苯挥发后再次放入二甲苯中透明密封剂浓度适当，密封时先将盖玻片侧放置在滴有橡胶的组织切片上，然后慢慢放下，完全排除空气，密封时水蒸气不会进入10。我觉得做高质量的切片的关键是责任感。 如果每个人每天都能够为患者安身的话，就要严格遵守操作程序，通常的石蜡切片的质量会越来越好。参考文献：1王说明书、孙敏、白志川.构造植物学考试指导M .西南师范大学出版社，20032黄南平.正烷基-己内酰胺的合成及其在植物材料染色中的应用J .江西科学，2003，21 (1):64-663关于荣伟、刘海燕.石蜡切片染色中脱蜡的探讨J .解剖学杂志，200629(1):91 .4叶创兴、冯虎元等.植物学考试指导M .清华大学出版社，20065何凤仙，主编.