链霉素发酵工艺验证方案要点

链霉素发酵过程验证方案1.目的：确定链霉素发酵系统的工艺流程，确定种子流程、小罐流程、小罐流程、中罐流程和大罐发酵流程，验证发酵系统流程的稳定性和可靠性，以及制备的发酵液是否满足中间规格的要求。2.范围：该计划包括一个50吨大罐链霉素发酵液的生产过程。2.1验证地点：403车间发酵工段：2.2验证对象：2.2.1原始坡度2.2.2第1代和第2代斜坡2.2.3母瓶2.2.4子底部2.2.5小罐2.2.6小罐2.2.7中型储罐2.2.8大罐2.3验证步骤：确定验证计划、验证计划、内容和步骤，以准确验证链霉素发酵系统。3.核查措施概述：3.1生产记录：原始坡度：冷藏期10天无菌外观外观菌落：白色丰满正常第1代或第2代斜坡：冷藏期14天无菌外观外观群体：白色丰满，正常母瓶：无菌斜面和无菌外观菌丝厚，米色，无颗粒状菌丝。效价1700u/ml持续68小时效价96小时3500u/ml滴定度120小时6700u/ml冷藏期5天细菌年龄为50-64小时菌丝体ii-iii底层：无菌斜坡和无菌外观菌丝厚，米色，无颗粒状菌丝。滴定度120小时7000u/ml效价144小时7500u/ml冷藏期7天细菌年龄为30-44小时菌丝体ii-iii小罐子：菌丝ii-iii无菌显微镜检查灌封效价800u/ml，残留碳3.5g/100ml，残留氮140mg/100ml，酸碱度7.5小罐子：菌丝ii-iii无菌显微镜检查灌封效力1200u/ml，残留碳3.5g/100ml，残留氮140mg/100ml。酸碱度7.5培养基罐：菌丝ii-iii无菌显微镜检查灌封效价1800u/ml，残留碳3.5g/100ml，残留氮140mg/100ml。酸碱度7.5大罐：将剩余糖放入 2.0g/100ml的罐中储罐中的残余氮小于或等于120毫克/100毫升。容器的透明度大于等于40%灌封滴度14000u/ml3.2原材料：生产过程中使用的各种原材料及其规格(见原材料清单)3.3设备：链霉素生产设备见设备清单。3.4上述设备的每一部分都必须经过适当的认证(智商/OQ)，并且任何相关的测试设备都必须在验证前进行校准。3.5人员培训，作为验证研究的一部分，每个参与链霉素发酵的员工都经过了GMP和相关标准操作程序的培训。4.生产程序和流程图：4.1生产过程描述：4.1.1我厂用于生物合成链霉素生产的菌株是灰色链霉菌。为了保持菌株的活力和稳定性，将孢子储存在干燥的沙子中，并在24的冰库中冷藏，或者将孢子制成乳悬液，并在 196的液氮中密封冷藏。生产菌株每年自然分离两次，以控制菌落变异率5%，并检测八代菌丝的遗传稳定性，以检测母女俩代谢和效价单位的稳定性。挖干净的海滩细砂(不会污染各种有机物)，用自来水冲洗干净，冲洗至浮水清澈不浑浊，干燥，过100目筛，充分吸收沙子中的铁屑备用，在郊区地面挖两英尺深的黄土(不会污染各种有机物)，用自来水充分冲洗消毒，冲洗至浮水清澈，干燥，过120目筛，用磁铁充分吸收土壤中的铁屑备用。将上述处理过的砂和土按1份土和2份砂的比例混合，装入玻璃试管(12100毫米)，每管1克，用纱布填塞紧装在小铜丝筐内，在灭菌锅内灭菌，间歇灭菌3次，每次压力为0.12兆帕，温度为122，时间为1小时，灭菌后在电炉内干燥，110-120，4-5小时， 在外面注明批号和日期备用，并根据上述要求再次灭菌和干燥，以确保使用前无菌。取一个符合质量要求的孢子斜面，在无菌操作下，加入约1毫升0.85%的氯化钠无菌生理盐水，用1号棒轻轻刮去表面孢子(防止割胶用力过大)，摇匀，用1毫升割头无菌吸管吸出，准确、小心地将0.1毫升孢子溶液加入每个无菌空白砂管中(加入时，注意将吸管伸到靠近砂的地方，但不要碰到砂，也不要使吸管口与砂嘴和内壁接触)。将棉花塞塞紧，将沙子敲松并摊开，放入真空干燥器(干燥器中放入氯化钙干燥剂)以保持0.10兆帕的真空度，在泵送4片时保持泵送4小时，在泵送5片或更多片时适当增加泵送时间，取出排出的沙子孢子，敲松并放入装有无水氯化钙的广口瓶中，盖紧盖子，储存在2 4的冰库中备用。使用时，采用干接种。孢子砂管的有效使用寿命为2年。市场上出售的鲜奶以3000转/分的速度离心三次，上层脂肪被丢弃15分钟。将脱脂奶置于115-117，0.07兆帕的试管中，灭菌15-20分钟。将空白安培管清洗干燥，塞住棉花，放入121的灭菌锅内60分钟，间歇灭菌三次，备用。取一个符合质量要求的孢子斜面，加入5-10毫升无菌脱脂乳，用2号棒轻轻刮去孢子，用无菌吸管吸取孢子乳悬液，放入无菌珠瓶中，摇匀10分钟，然后将珠瓶中的孢子乳悬液加入装有1毫升无菌吸管的无菌安培管中，0.3毫升/支，标记，液氮保存，保存5年。4.1.2种子组的洁净等级为100。每三个月测量一次灰尘颗粒(0.5u灰尘3.5颗粒/1L空气)、风速(0.35米/秒)和无菌度(两个盘子定点打开30分钟1个盘子)。平时，每次操作在固定点打开两个培养皿30分钟，以控制菌落数1个/皿。每天用预紫外线灯消毒一小时，每三个月更换一次消毒剂(1/600吉摩尔，75%酒精)。4.1.3孢子坡度：将生产用的孢子沙管或孢子冷冻管放在无菌室中，用操作杆勺取适量孢子接种在斜面培养基上，尽可能包被孢子形成长的单个菌落，然后在271的恒温室内培养6-7天，生长的孢子斜面称为原始斜面，仅用于孢子传代，不能制备母瓶，液氮冷冻孢子与原始斜面相连。根据质量情况，母瓶可适当考虑制作，在2-4冷藏条件下，有效使用期不得超过10天。除了一些异常菌落外，斜面的外观应该主要是白色、丰满的梅花形、馒头形和圆形菌落。第一代选择原始斜面上的2-3个正常孢子菌落，第一代斜面用于相同的点种植第二代斜面、第一代斜面和第二代斜面。培养条件为27l恒温室内培养6-7天，第一代和第二代斜面有效使用期为14天，可制成母瓶。孢子斜面会传给第二代，而不是第三代。母瓶挖成的剩余孢子斜面应在冰箱中保存一个月以备检查。斜面培养基的制备：名字比例%注射用葡萄糖0.81.2蛋白胨0.30.6氯化钠0.40.6豌豆浸出液1216琼脂(海盐品牌)2.02.8公共卫生7.07.4消除后，规格：C (g/100ml)0.9-1.2n(毫克/100毫升)32-38p(微克/毫升)60-90公共卫生6.8-7.5豌豆浸出液的制备；豌豆：30克氯仿：0.5%(次要)自来水：加至1000毫升1M H2SO4:用于调节酸碱度将30克豌豆洗净并沥干水分，加入1000毫升自来水，用1MH2SO4调节酸碱度至4.2-4.5，加入0.5%氯仿，用砂瓶塞盖好，摇匀，释放气体，盖紧盖子，放入37恒温器中一昼夜，取出，用1M H2SO4调节酸碱度至4.2-4.5，加入0.5%氯仿，摇匀，盖紧盖子，放入371恒温器中6天。粗滤除去豌豆，将滤液放入敞口搪瓷杯中，在沸水浴中煮沸20分钟(除去氯仿)，冷却，用滤纸过滤除去沉淀的蛋白质，分装在750毫升摇瓶中，在0.09兆帕、118-120下灭菌20分钟，冷却，放入冰箱备用。同时，应发送样品进行测试和质量检查。使用这批豌豆浸出液时，必须另送一份样品。当测定的氨氮含量接近第一个时，可以根据后一个样品的含量进行计算和使用。如果第二个内容与第一个内容不一致，则应根据最后一次试验数据再次抽取第二个样本进行计算和使用。豌豆浸出液的质量：项目规格出现沉清液体氨氮170200mg/100ml磷(PO4)大约600微克/100毫升无菌条件没有杂菌4.1.4母瓶：在无菌室，用挖块法将孢子接种到两个准备好的符合质量标准(冷藏期不超过14天)的分生孢子斜面相同的摇瓶中，孢子分别编号为母种一和母种二；接种后，将孢子送至27l的恒温摇瓶室，在23020r/mm摇瓶机上培养50-64小时，菌丝第二-三阶段开始时的母种一用牛皮纸包好，保存在瓶中在2 4的冷库中，母种二将继续培养进行质量检验，并分别进行27和37的两次无菌试验。单位粘度、氨氮消耗量、酸碱度、单位/毫升。应每24小时取样一次，以确定上述项目，共三次(68小时、96小时和120小时)。如果母瓶质量符合要求，母瓶可以放入罐中使用。母瓶的有效冷藏期为5天。制备好的母瓶应具有粘稠的菌丝，目测未发现菌丝团。米色颗粒，无异味，无稀释，无菌，正常。效价：120小时 6700单位/毫升。接收子瓶的母瓶的制备方法是通过无菌操作挖一个斜面，连接母瓶，在摇瓶机上培养50-64小时，取下母瓶，选择外观正常、菌丝厚、米黄色、无颗粒状菌丝的母瓶作为接收子瓶的母瓶，接收子瓶的母瓶不冷藏。如遇特殊情况，一般冷藏不得超过5天。母瓶的原料及配比如下：原料比例%葡萄糖3.55.5豆饼粉3.04.5碳酸钙0.50.8硫酸铵0.50.8氯化钠0.250.5磷酸二氢钾0.040.07剔除后的质量规格：c(克/毫升)3.84.8n(毫克/100毫升)130155p(微克/100毫升)1301554.1.4子底部：取符合种子质量标准的母瓶，在无菌操作条件下，将准备好的子瓶培养基与吸管连接，每瓶接种量约为3毫升，根据需要确定瓶数(母瓶与子瓶连接前制作两个无菌测试斜面，分别在27、37恒温箱中培养，母瓶与子瓶连接后，吸管制作成无菌测试斜面，在37恒温箱中培养)，接种后子瓶出厂在27l恒温室中培养30-44小时，菌丝期在ii-iii期开始。生长后，留下五瓶用于进一步培养，以进行质量分析。其中，三瓶分别在120和144小时取样测定效价，一瓶用于测定粘度和氨氮，一瓶连接两个无菌斜面进行无菌试验(分别在27和37恒温室中培养)并观察菌丝形态。(应测量新菌株的温度和酸碱度)其他瓶子应在2 4的冰库中冷藏7天。如有稀疏现象或怀疑将某一罐的种子移植到下一级罐后，应对罐进行冲洗，并更换阀垫以检查密封性。检查部分包括配气管、搅拌轴封、法兰焊接连接罐和阀门等。如果储罐被污染，应说明下一个排空期应延长15分钟，并检查过滤器是否有培养基回流。培养基实际上是无菌的：预热至怠速时压力达到0.16 0.19兆帕。排出罐内冷凝水后，计算冷却时间为15-45分钟，温度为125-130，待压力下降后，冷却时间降至0兆帕，进行进料和冷却。首先向搅拌处加水，然后加入配制好的培养基，搅拌成匀浆，加热，打开各支管的蒸汽，当压力升至0.07-0.12兆帕，消毒温度为115-124时，关闭罐盖，时间约20分钟，完成后，保持压力，冷却接种，完成后取消样品的碳、氮、磷和酸碱度的测定。通过摇动2-8瓶火焰，将空气流速增加到0.1m 3/min，将5小时流速增加到0.5m 3/min来接种小罐，可以将一个小罐种子移入2-3个小罐中供种子使用。此后，每4小时取一次无菌样品，每8小时测量一次酸碱度和菌丝浓度，并在罐中测量碳和滴定度。从大约25小时开始每8小时测量一次氮。种子罐标准菌丝处于二至三期初期。无菌的。接种前2小时，必须在显微镜下检查种子液涂片的细菌情况。培养条件为271，35030 r/min，46-68h，0.5m3/min。如果种子罐生长过程中新陈代谢过快，可以适时降低温度进行培养。如果新陈代谢缓慢，种子槽的酸碱度会上升，通气量会减少，配方等技术调整措施也会调整。小罐的原料及配比如下：原材料名称小型油箱(120升)比例%小型油箱(500升)比例%葡萄糖3.55.54.55.5豆饼粉2.53.52.53.5硫酸铵0.50.70.50.7碳酸钙0.20.70.20.7磷酸二氢钾0.0450.070.050.07玉米浆0.1 0.2(移动)0.1 0.2(移动)大豆油1L/批处理1L/批处理氯化钠0.10.20.10.2批量100升250升缩小体积100升250升剔除后，规格如下公共卫生淘汰后c消除n后淘汰p后小罐子6.08.02.84.4115170120200小型储罐控制规格：(1)消除后，CNP必须满足质量要求。如不符合要求，应重新喂养并消毒。(2)中间控制温度必须为271，如果长时间超过30，不能作为种子使用。(3)污染槽不能用作种子。(4)氨氮必须在中间代谢过程中逐步使用，如果以后恢复，就不能作为种子使用。(5)罐装控制：残糖3.5g/100ml，残