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Enzymology，第三章酶学，酶的概念，酶(enzyme )由活细胞产生，是其基质具有高度特异性和高度催化性能的蛋白质。 酶学研究简史，公元前二千多年，我国已有酿酒记录。 一百多年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。 1878年，Khan第一次提到Enzyme这个词。 1897年，EduardBuchner在不含细胞的酵母提取液中实现了发酵。 1926年，Sumner首次从刀豆中提炼出脲酶结晶(deoxyribozyme )。 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶催化活性，提出了核酶(ribozyme )的概念。 1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称为脱氧核糖酶(deoxyribozyme )。 第一节酶的分子结构和功能themolecurrectrurrestructureandfunctionofenzyme，酶的不同形式：单体酶(monomericenzyme ) :由单个亚基组成的酶。 寡聚酶(oligomericenzyme ) :同一或不同亚基以非共价键结合的酶。 聚合酶系(multienzymesystem ) :几种不同功能的酶相互聚合，形成聚合酶系或聚合酶复合体。 多功能酶(multifunctionalenzyme )或串联酶(tandemenzyme ) :一些多酶体系在进化过程中由于基因融合，多种不同的催化功能存在于一个多肽链中，这种酶称为多功能酶。 另一方面，酶的分子组成中常常含有辅助因子，结合酶(conjugatedenzyme ) :由蛋白质部分和非蛋白质部分构成的酶，简单酶(simpleenzyme ) :仅含蛋白质的酶称为简单酶，全酶分子的各部分作用于催化反应： 酶蛋白决定反应的特异辅助因子决定了反应的种类和性质，辅助因子多为(取决于与酶蛋白结合的程度)、辅助因子为小分子有机化合物和金属离子。 作为辅助因子的有机化合物，b族维生素的衍生物和卟啉化合物在酶反应中主要参与电子、质子(或基团)或载体的传递作用，某些辅酶(辅助基团)作用于催化剂，金属酶(metalloenzyme )金属离子与酶结合，在提取过程中难以消失。 金属活化酶(metal-activatedenzyme )的金属离子对酶的活性是必需的，但与酶的结合不太紧密。 金属离子是最常见的辅助因子，金属离子的作用：参与催化反应，中和传导电子的酶与基质相连的稳定酶的构象阴离子，降低反应中的静电排斥力等。 一些金属酶和金属活化酶二是酶的活性中心是酶分子中执行其催化功能的部位，酶的活性中心或活性部位(activesite )是酶分子中与基质特异性结合，基质转化为产物的具有特定三维结构的区域。 酶的活性中心(activecenter )、酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，有与酶活性密切相关的化学基团。必需基团(essentialgroup )、活性中心内的必需基团、活性中心以外，为了维持应处于酶活性中心的空间构象和作为调节剂的结合部位是必需的。 活性中心以外的必需基团、基质、活性中心以外的必需基团、键合基团、催化剂基团、活性中心、溶菌酶的活性中心、溶菌酶的活性中心是龟裂，与能够容纳肽多糖类的6个单糖基(a、b、c、d、e、f )形成氢键和vanderwaals力。 催化剂基团为35位Glu，52位Asp的101位Asp和108位Trp为结合基。 三、同工酶催化同一化学反应，同工酶(isoenzyme )催化同一化学反应，是指酶蛋白分子结构、理化性质以及免疫学性质不同的酶群。 根据国际生物化学学会的定义，同工酶是由不同基因编码的多肽链或由同一基因转录的不同mRNA翻译的不同多肽链组成的蛋白质。 同工酶存在于同一属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同子细胞结构中，使不同组织、器官和不同子细胞结构具有不同的代谢特征。 这为同工酶诊断不同器官疾病提供了理论依据。乳酸脱氢酶同工酶，例1，人体各组织器官LDH同工酶谱(活性% )，检测组织器官同工酶的变化具有重要的临床意义，用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征同工酶谱的变化对疾病的诊断例2 :b，b，m，m，CK1(BB)CK2(MB)CK3(MM )，脑心肌肉骨骼肌，肌酸激酶(creatinekinase )， CK )同工酶、CK2作为临床早期诊断心肌梗死的生化指标，第二节酶的工作原理TheMechanismofEnzymeAction只能在反应前后没有质量和量的变化，只能改变催化热力学允许的化学反应的反应平衡，加快可逆反应的过程。 酶与一般催化剂的共同点： (1)酶对基质效率极高，另一方面酶具有促进反应的特点，酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。 酶的催化剂不需要高反应温度。 酶和一般催化剂加速反应的机理是降低反应的活化能。 酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。 一些酶与一般催化剂的催化效率比较表明，一种酶只作用于一种化合物或一定的化学键，催化一定的化学反应，产生一定的产物。 酶的这种特性称为酶的特异性或特异性。 酶的特异性(specificity )、(ii )酶对底物有很高的特异性，根据酶的底物选择特点，酶的特异性可分为两类：1.绝对特异性(absolutespecificity )只作用于特定结构的底物，进行特异性反应，生成特定结构的产物尿素酶只能水解尿素生成CO2和NH3。 一些具有绝对特异性的酶能够区分光学异构体和立体异构体，只能催化一种光学异构体或立体异构体发生反应。 例如，乳酸脱氢酶仅催化L-乳酸脱氢生成丙酮酸，对D-乳酸不起作用。 2 .相对特异性(relativespecificity )，一些酶对基质的特异性不是通过整个基质分子结构，而是通过基质分子中的特定化学键或特定基团作用于含有相同化学键或化学基团的化合物。 例如，消化系统的蛋白酶只对蛋白质中肽键的氨基酸残基种类有选择性，对具体的基质蛋白质种类没有严格要求。 (3)酶的活性和酶量可调节，酶反应受多种因素控制，适应生物体对不断变化的内外环境和生命活动的需求。 果糖激酶-1的活性被AMP的异性激活，被ATP的异性抑制。 胰岛素诱导HMG-CoA还原酶的合成，胆固醇阻碍该酶的合成。 例：(四)酶不稳定，酶的化学本质主要是蛋白质。 某些理化因素(高温、强酸、强碱等)使酶改性失去催化活性。 因此，酶反应多在常温、常压、接近中性的条件下进行。 二、酶通过促进基质的过渡状态来提高反应速度；(一)酶比一般催化剂更有效地降低反应活化能，酶和一般催化剂一样促进反应的作用都是通过降低反应活化能来实现的。 活化能：基质分子从基态变为过渡状态所需要的能量。 (二)酶与基质结合形成中间产物，酶基质复合体通过诱导拟合作用使酶与基质紧密结合，当酶与基质接近时，其结构相互诱导、相互变形、相互适应，进而相互结合。 这个过程称为酶基质键的诱导适应(induced-fit )。 羧肽酶的诱导适应模式，2 .接近效应和定向序列使各基质正确定位于酶的活性中心，酶在反应中使各基质与酶的活性中心结合，使它们相互接近，形成有利于反应的正确定向关系。 这种邻近效应和定向排列实际上使分子间的反应类似于分子内的反应，提高了反应速度。、邻近效应和取向序列：酶的活性中心多为酶分子内部的疏水“袋”，酶反应在该疏水环境中进行，使基质分子脱溶剂化，排除周围多数水分子对酶和基质分子中功能基团的干扰性吸引和排斥，防止水合膜的形成，有利于基质和酶分子的紧密接触和结合这种现象叫做表面效应。 3、表面效应使基质分子脱溶剂化，胰蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性中心“口袋”，(3)酶的催化机制呈多价催化作用，1 )亲核催化作用(nucleophiliccatalysis)2)共价催化作用(covalentcatalysis)3) 亲电催化剂(electrophiliccatalysis) 1.酸-碱催化作用(generalacid-basecatalysis )，2 .亲核催化剂和电子催化作用，胰蛋白酶共有催化剂和酸-碱催化机理，第三节酶促进反应动力学kinticsofzyme-catalogyzede 影响因素有酶浓度、基质浓度、pH、温度、抑制剂、活化剂等。一、基质浓度对反应速度的影响曲线呈矩形双曲线，其他因素不变时，基质浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。基质浓度低时：反应速度与基质浓度成比例的反应为一次反应。 随着基质浓度的提高，反应速度不成比例加速的反应是混合反应。 基质浓度升高到一定程度后，反应速度不会增加，达到最大速度的反应零级反应、单基质、单生成物反应； 酶的反应促进速度一般在规定的反应条件下，以单位时间内的基质的消耗量和生成物的生成量表示的反应速度为其初始速度，即基质的消耗量小(一般为5%以内)时的反应速度的基质浓度远大于酶浓度。 研究前提： (1)米-曼方程阐明了单基质反应的动力学特性，1913年迈克尔和Menten提出了反应速率和基质浓度关系的数学方程，即米-曼方程，简称迈克尔方程.s :基质浓度v :不同S时的反应速度Vmax :最大反应速度(maximumvelocity)Km :米氏常数(Michaelisconstant )、e和s形成ES复合体的反应为急速平衡反应，但ES分解为e和p的反应为慢反应，反应速度慢(1)由于s的总浓度远大于e的总浓度，因此在反应的初期阶段，s的浓度不变，即S=St。 米-曼方程的导出基于两个假设：米-曼方程的导出过程：ES的生成速度=ES的分解速度：中，(:(Et-ES)S=KmES，整理：k1(Et-ES)S=k2ES k3ES，当反应处于稳定状态时：基质浓度高若将(5)代入酶活性中心全部饱和时即Et=ES、反应到达最大速度Vmax=k3ES=k3Et(5)，则满足下式： (2.Km和Vm是重要的酶促反应动力学参数，1.Km的值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的基质浓度，反应速度为最大反应速度一半时：Km=S，2.Km的值为酶的特征常数，Km的值大小不一定，与酶的结构、基质结构、反应环境的pH和某酶对基质的Km、3.Km在一定条件下表示酶对基质的亲和力，Km越大，表示酶对基质的亲和力越小，酶对基质的亲和力越大。 4.Vmax是酶在基质中完全饱和时的反应速度，当所有酶与基质形成ES时(即ES=Et )，反应速度最大，Vmax=k3Et。 5 .酶的转化数，当酶完全饱和于基质时(Vmax )，单位时间内酶分子(或活性中心)催化基质转化为产物的分子数称为酶的转化数(turnovernumber )，单位为s-1。酶的转化数可用来表示酶的催化效率。 1 .双倒数绘图法(doublereciprocalplot )，又称林-贝氏绘图法，(3)km值和Vmax常用林-贝氏绘图法求出，2.Hanes绘图法基于林-贝氏方程，两侧有S， s /v=km/VMAX 二、基质充足时酶浓度对反应速率的影响呈线性关系，酶促反应系统中基质浓度大大超过酶浓度，酶饱和基质时反应速率达到最大速率。 此时，反应速度和酶浓度的变化呈比例关系。 当酶在基质中饱和时，反应速率与酶浓度成正比。 关系式为V=k3E、V=k3E，SE时，Vmax=k3E、酶浓度对反应速度的影响、三、温度对酶反应速度的影响有二重性，温度对酶反应速度有双重影响. 酶反应速度最快时反应体系的温度称为酶反应的最佳温度(optimumtemperaturetemperature )。 温度对酶活性的影响，酶的最佳温度不是酶的特征常数，而是与反应进行的时间有关。 酶的活性随温度的下降而降低，但在低温下酶不会被破坏。 温度恢复后，酶又恢复活性。 四、pH通过改变酶与基质分子的解离状态影响酶的反应速度，将酶催化活性最高时反应体系的pH称为促进酶反应的最佳pH(optimumpH )。 pH对某些酶活性的影响，最佳pH不是酶的特征常数，而是受基质浓度、缓冲液种类和浓度、酶纯度等因素的影响。 五、抑制剂可以降低酶的反应速度，酶的抑制剂(inhibitor )、酶的抑制可以区分为酶的改性，抑制剂对酶具有一定选择性，引起改性的因素对酶没有选择性，降低酶的催化活性，不引起酶蛋白改性的称为酶的抑制剂。 抑制作用的类型：“可逆抑制”、“可逆抑制”和“竞争抑制”非竞争抑制(non-competitiv