实验八-凝胶过滤分离高铁血红蛋白和高铁氰化钾PPT课件

实验八凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾,了解凝胶层析的原理及应用通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术,实验目的,凝胶过滤层析：,是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也称分子筛层析、排阻层析,实验原理,单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。,交联葡聚糖的凝胶颗粒,分子筛效应：大分子在前，小分子在后,高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色，Mw=64500)，完全排阻,HbK3Fe(CN)6,MetHb,高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色，Mw=327.25)，可完全进入凝胶颗粒网孔内，从而达到分离的目的,交联葡聚糖,高铁血红蛋白与高铁氰化钾混合物,高铁血红蛋白,高铁氰化钾,利用特制的半透膜把大小分子分开的方法，截止分子量一般为一万,临床应用：血液透析,透析液,浓缩的蛋白混合样品,透析袋,开始透析,处于平衡状态,透析法：,钼酸铵+氨基萘酚磺酸+磷酸盐,钼蓝（蓝色）,15%三氯醋酸+蛋白质,变性、沉淀,实验器材与试剂,层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器,血红蛋白溶液,交联葡聚糖G-25,0.4%K3Fe(CN)6,氨基萘酚磺酸试剂,钼酸铵试剂,15%三氯醋酸,0.1M磷酸缓冲液,实验步骤,凝胶的处理,G-25颗粒(5g),蒸馏水室温溶胀,去除杂质,10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜),装柱,固定在铁架上,加入缓冲液没过砂芯,将凝胶缓缓注入管内,自然沉降至柱床高度达20cm以上不可露出创面盖滤纸,层析管洗净、排出管中气泡,关闭出口,关闭出口,打开出口,装柱要求:,连续均匀无气泡无分层床面平整,层析柱稳定后接储液瓶，打开出口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱平衡(5-10min)，不可露出床面，关闭出口,平衡,加样,准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6(8滴)混合液,自距床面1mm高处靠壁缓慢、均匀加入,至液面降至与凝胶面相平,放掉多余缓冲液至刚露出床面,打开出口,洗脱与收集,至洗脱液刚好流入床面,再加洗脱液至3-4cm高,连接储液瓶调节活塞（1滴/5秒）进行洗脱,缓慢加入样品量体积的洗脱液（不冲破胶面）,打开出口,关闭出口,收集红褐色的MetHb色带,带网孔的葡聚糖珠,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,凝胶过滤层析过程示意图,用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中的凝胶吹至小烧杯中回收,洗脱与收集,将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后，用23倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶,将MetHb洗脱液装入透析袋,将透析袋口用止水夹密封,打开磁力搅拌器，透析30分钟,将透析袋悬入装有蒸馏水的烧杯中,透析,磷酸盐的鉴定,鉴定,蛋白质的鉴定,装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者重新装柱，保持柱床面平整；洗脱时流速不可太快或太慢；透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋胀破。,注意事项,磷酸盐的鉴定,无,蓝色,实验结果,蛋白质的鉴定,无,无,有沉淀,MetHb的相对分子量较大，直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较短，移动速度快，首先流出,K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中流程较长，移动速度慢，最后流出,磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径的小，能够穿过透析袋；而蛋白质是大分子，不能透过透析袋，只能保留在袋中,向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或太慢？圆盘电泳的分子筛效应和凝