第八章环境毒理学常用研究方法ppt课件

.,第八章环境毒理学常用研究方法,.,毒理学研究方法,.,第一节实验准备,1.1动物的准备选择实验动物编号与标记固定与麻醉,.,（1）选择实验动物,黏膜刺激,高血压,.,1）种属的选择原则在机体反应上与人体近似易获得、易饲养、易管理敏感、合适实验资料,.,.,大鼠致癌,豚鼠过敏反应,.,常用动物介绍,猫气体、蒸气对黏膜的刺激豚鼠或兔皮肤豚鼠过敏性反应猫、狗、兔呕吐兔和猫体温狗、兔、大鼠血压大鼠和小鼠致癌小鼠慢性中毒对脏器的损害,.,2）个体选择年龄：幼年成年，急性实验成年性别：无特殊要求就雌雄各半生理状态：如怀孕、哺乳健康状态：检查、预检,.,（2）实验动物的标记编号,染色、烙印、号牌,大动物：记录外表和毛色,.,（3）实验动物的捕捉及固定,做好防护戴厚手套用器具固定,.,.,.,.,.,（4）实验动物的随机分组,分2组：,任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录14个数,再抄录一个数字为78，因为归入A组的小鼠有8只，故以8除，得余数6。于是把第6个A（即编写为第12号的小鼠）划给B组,.,分3组：,再取一个随机数除以6，看余数,.,（5）实验动物的麻醉,动外科手术避免剧烈挣扎麻醉药物：乙醚,.,（1）全身麻醉a）吸入法：开放法、封闭法挥发性b）腹腔和静脉给药麻醉法非挥发性（2）局部麻醉a）猫：一般应用0.5-1.0%盐酸普鲁卡因注射。粘膜表面麻醉宜用2%盐酸可卡因b）兔在眼球手术时，可于结膜囊滴入0.02%盐酸可卡因溶液，数秒钟即可出现麻醉c）狗：用0.5-1%盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉表面麻醉可用2%盐酸可卡因,.,.,麻醉注意事项,（1）静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤夹捏的反应。当这些活动明显减弱或消失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中。（2）麻醉时需注意保温。麻醉期间，动物的体温调节机能往往受到抑制，出现体温下降。保温的方法有：实验桌内装灯，电褥，台灯照射等。无论用哪种方法加温都应根据动物的肛门体温而定。（3）慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。,.,1.2毒物的准备,（1）了解毒物的物理常数密度、溶解度、蒸汽压、熔点、沸点、油/水分配系数等（2）剂型：毒性高、刺激性大稀释固态溶液、软膏,.,（3）溶剂：本身毒性很小或无毒不与受检毒物产生增毒或减毒作用不影响毒物吸收无特殊的刺激性或气味,.,1.3生物材料的采集和制备,（1）血液的采集需求少刺破组织取毛细血管的血需求多静脉采血、动脉注意：光线、温度、器皿消毒、抗凝剂,.,割（剪）尾取血眼眶静脉丛采血断头取血颈动脉取血腹主动脉股动（静）脉取血,.,.,.,（2）尿液的收集,连续收集在代谢笼下配置粪尿分离漏斗一次性尿液收集逼尿法、导尿法、输尿管插管法剖腹采集尿液、提鼠采集尿液,.,.,尿液收集注意事项,实验期间膳食一致，特定时间完成收集防止尿液的污染标本迅速测定或冷冻保存避免器皿污染灌喂水或青菜满足尿量需求,.,（3）粪便的收集,代谢笼、粪尿分离器外观形态新鲜、完整，分析时取内层粪便器皿干净,.,（4）呼出气的收集,研究毒物的吸收代谢和对肺功能的影响动物需固定,.,（5）组织匀浆的制备,酶：取样洗净研磨离心测定用于毒物的测定,.,1.4预备试验,（1）选择合适的实验动物（2）设计染毒剂量及其分组（3）操作技术的检验和训练（4）发现新线索、新指标,.,第二节常用染毒技术,2.常用染毒途径吸入染毒、经皮肤染毒最重要的灌胃气管注入注射（腹腔、静脉、肌内、皮下）,.,根据实验目的进行选择，同时考虑：（1）人群接触环境毒物的实际情况生产车间呼吸道（2）毒物的理化性质固态、液态、气态（3）受检毒物的来源消耗量的大小,.,2.1吸入染毒法大气污染物,1）动式吸入染毒法,优点：柜内毒物浓度相对稳定受试环境具有持久的稳定性缺点：毒物消耗量大,.,2）静式吸入染毒法急性,在具有一定气体容积的密闭容器中或在密封染毒柜内进行,优点：设备简单，操作方便缺点：要经过一段时间才能达到实验浓度要求,.,3）面罩染毒法,优点：避免皮肤吸收注意检查面罩的密封性,4）吸入染尘法,颗粒污染物5LD50，蓄积作用不明显剂量定期递增染毒法（等比递增）20天蓄积实验法停药7天内死亡情况,.,LD50,K5,轻度蓄积,.,5.3蓄积率的测定方法,蓄积率,100,蓄积量对照组LD50预给组LD50,.,第六节亚慢性和慢性毒性实验,必须先做蓄积实验判断可能性6.1亚慢性毒性实验(1/301/20)动物要求敏感、两种（啮齿类、非啮齿类）健康、年幼剂量（高、中、低）一般取LD50的1/801/50，每天定时染毒，剂量相等观察指标一般指标、生化指标、病理学检查,.,6.2慢性毒性实验,实验时间一般要求12年或者终生染毒一般要求选用几种动物，年龄要小设34个剂量组和一个对照组LD50的1/10001/20之间取34个剂量注意事项：指标提前观察、同步进行、注意异常情况、延长饲养时间继续观察,.,第七节致癌性实验,7.1长期动物实验实验动物的选择：抗病力强、容易饲养、肿瘤自发率低、寿命长、对受试物敏感。两种或以上动物动物数目：小型动物50只；大型减少剂量分组与对照（阴性、阳性对照）：高剂量（加速致癌）、低剂量（接近人类）,.,染毒途径：口、皮肤、注射实验时间：动物生命期的1/31/2指标观测：外表、行为、X射线、病理学检查结果评判：潜伏期：第一例病理学检查：恶性、良性、癌前期变阳性结果的判断：肿瘤数、潜伏期短,.,7.2短期筛检方法,Ames实验：外源化学物致突变作用DNA修复测定：3H-Tdr哺乳动物细胞的体外恶性转化,.,Ames试验,组氨酸营养缺陷型菌株（His-）His-His+哺乳动物微粒体酶前致癌物,受试物,组氨酸缺乏培养基,S-9混合液,致突变物,.,DNA修复测定,蔗糖密度梯度离心技术切除片段大小沉降速度放射自显影技术直接定位损伤部位,.,第八节致突变实验,一、哺乳动物细胞突变试验正常细胞酶的缺失突变细胞能与有害物共存突变细胞不能与有害物共存,回复突变,正向突变,正常细胞,.,二、染色体畸变试验,哺乳动物体内骨髓细胞遗传学试验人外周血淋巴细胞遗传学试验(T、Bcell),观察染色体的完整性,未分裂，G0期,加秋水仙素抑制有丝分裂，使染色体停滞在分裂中期,.,三、微核试验,用于检测染色体断裂剂（诱裂剂）和纺锤体毒物小鼠或大鼠骨髓高剂量每只动物计数1000个以上嗜多染红细胞评价：正常水平：单个动物0.4；一组动物0