实验五：ELISA法检查乙肝表面抗原(HBsAg)

.,实验五：ELISA法检测乙肝表面抗原（HBsAg）,主讲人：季煜华2014年11月,.,免疫标记技术,定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP,.,用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性,荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）,放射性同位素：125I、131I,酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶,免疫荧光检测法（IFA）,放射免疫检测法（RIA）,酶免疫检测法（EIA）,免疫标记技术,.,免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,.,酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA),酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）,简称ELISA，它是实验室最常用的检测方法，用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原。ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。,1.简介,.,(1).抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。(2).抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；(3).酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进行定性或定量分析。,2、ELISA基本原理,.,3、ELISA基本的实验过程,包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化；抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定；酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。,.,ELISA的试剂,ELISA中有3个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（聚苯乙烯板：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性）（2）酶标记的抗原或抗体（标记物）；（3）酶作用的底物（显色剂）；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）样品及标准本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液,.,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。,4、ELISA类别,.,双抗体夹心法,.,间接法,.,5、操作步骤（以双抗体夹心法ELISA为例）：,清洗,清洗,清洗,终止反应，底物显色深浅与待检抗原量成正比。利用已知浓度的抗原制成标准品，稀释为梯度浓度，对其最终OD值与浓度作标准曲线，那么样品的浓度可以根据最终的OD值在标准曲线上查出。,.,实验内容：双抗体夹心法测定乙肝表面抗原（HBsAg）定性定量检测,.,1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应用,实验目的,.,实验材料,HBsAg酶联免疫分析试剂盒HBsAg阳性品，阴性对照品移液枪，枪头湿盒酶标板，酶标仪一次性手套记号笔计时器,.,实验步骤,.,结果判定,定性测定定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性，N为阴性对照孔。定量测定：酶标仪测定450nm波长下的OD值，根据标准曲线计算样品抗原的浓度。,.,预期结果,阳性：显色为黄色阴性：无色,1234,阴性,阴性,阳性,阳性,.,ELISA注意事项,加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。洗涤必须彻底，防止产生假阳性；温育常采用的温度有43、37、室温和4等。37是实验室中常用