RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75乙醇，无RNase的水或0.5SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。操作步骤：1. 匀浆处理 a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol. b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%. c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。弃上清，收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。2. 将匀浆样品在15-30放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。3. 可选步骤:4 10 000rpm离心10min，取上清。如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。5. 4 10 000rpm离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相）6. 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，-20 放置20-30min。植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。7. 4 10 000rpm离心10min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。8. 加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。9. 4 10 000rpm离心2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。10. 室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100 的去离子甲酰胺溶解，-70保存。注意事项：1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) ：加800ul Trizol，样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。2. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70 放置一个月以上：RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 一个星期或-20 一年以上。如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70 长期保存。预防RNase污染，应注意以下几个方面：1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。不同组织或细胞RNA提取预期得率植物叶片 100-200ug/g叶片动物组织 200-400ug/g肝脏组织动植物培养细胞 5-10ug/106细胞大肠杆菌 2-10ug/mlDH5过夜菌血液 3-5ug/ml人全血问题指南：低得率A. 样品裂解或匀浆处理不彻底B. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A2801.65A. 检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下A280会较高。B. 样品匀浆时加的试剂量太少。C. 匀浆后样品未在室温放置5min。D. 水相中混有有机相。E. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解。RNA降解A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。B. 样品或提取的RNA沉淀保存于-5-20，未在-60-70保存。C. 细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。D. 溶液或离心管未经RNase去除处理。E. 电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。DNA污染A. 样品匀浆时加的试剂体积太少。B. 样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。 蛋白和多糖污染A. 样品中蛋白、多糖含量高。B. 样品量太大。C. 水相中混有有机相。D. 第6步中加入RNA助沉剂可以帮助去除这些污染。RNA提取一般步骤总结RNA提取原理： 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。实验步骤：破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA。1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入-ME可以抑制RNA酶活性。2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。4、 洗涤RNA使用70乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。5、 融解RNA一般使用TE。6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于- 70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000g离心5分钟。氯化锂法提取总RNA： 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA丢失的缺陷。试验试剂：1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】试验步骤：1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入510ml氯化锂尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。2、 匀桨液在04放置4小时后，12000g离心30分钟。3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液，重复步骤2。4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置1530分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，20放置1小时，5000g离心。6、 70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于70保存。蛋白酶热酚法本方法适合于病毒RNA的提取试验试剂：1、 蛋白酶K（终浓度50ug/ml）2、 2缓冲液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL试验步骤：1、 提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,3740-50分钟。2、 加入等体积65预热的酚溶液，轻徭,在65保温5分钟后再轻徭。3、 离心，取上清，氯仿抽提一次。4、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，20放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。5、 70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于70保存。RNA提取实验经验心得总结一：实验的准备实验之前必须先准备好相关的试剂和实验用品试剂：.TRIZOL,一步法提取用的，最好是INVITROGENE的，ml850RMB,不过也有国产的，便宜些这个试剂是非常关键的，也是不能省的，经常有很多朋友不想买这个，嫌贵，个人感觉是非买不可，不然用其他办法自己配的话也不便宜，而且配的过程中很毒2.异丙醇，无水乙醇，三氯甲烷（氯仿），.逆转录酶等一般如果做的次数不是很多的话可以买试剂盒的，里面什么都有，的也不是很贵，记得是次的多但是如果实验室做得比较多的话，还是自己分开买的比较好逆转录酶个人觉得的最好，而且不贵，其他公司我用得也不多，反正一直用，还有，oligod(T)n,RNA酶抑制剂，除了逆转录酶买的，其他的几样我都是买的的，因为promega的其他几样都很贵，这样配起来用一点也不比原装的差当然实验室比较富裕的也可以买好的，不过话说回来，咱们花的经费大多数还是民脂民膏，这些不太关键的地方省着点比较好（我是不是太罗嗦了！）.用具各种大小的枪头和管。由于RNA提取过程中对于RNA酶是非常敏感的，所以枪头和管子都要做灭酶处理。灭酶的正常程序是用加入DEPC 的水泡枪头和管子，过夜。DEPC的浓度是0.1%。DEPC是强致癌物，做的时候要戴手套口罩，作好防护措施。泡好后再高压，烘干。灭酶除了用DEPC处理外，还可以用氯仿泡枪头和管子，不用泡过夜，1-2小时就行，也没有DEPC那么恐怖，泡后也是高压烘干。5. 水。实验用的水也是很关键的，必须用DEPC处理灭过酶的水才可以。具体做法是将去离子水中加入0.1%DEPC，摇过夜，之后再高压。高压这步是不能省的，因为必须用高压把残留的DEPC分解掉，不然会影响后续的反应。二实验步骤TRIZOL提取RNA的原理就是利用变性剂将细胞裂解，释放出蛋白质，DNA，RNA，之后根据它们在不同PH值和不同极性溶剂中溶解度不一样。而把RNA提取出来。详细的原理可以自己查一查，在这里不做赘述。1. 样品处理 对于组织样品，书上说的办法是匀浆后加TRIZOL，但是我的经验是用匀浆器匀浆的话很多组织都是沾在匀浆器的壁上了，所以我一般都是用小剪刀剪，剪的时候要耐心，剪得很碎才行。一般样品其始量大概黄豆那么大一坨就行了，加1mlTRIZOL，然后在EP管中剪碎。样品尽量用新鲜的，不是新鲜的泡在PBS中一段时间也行。样品泡在TRIZOL里面后RNA就基本不会降解，这一步可以放在冰箱里面冻起来，可以保存一段时间2. RNA提取。往第一步中的剪碎的样品和TRIZOL中加入0.2ml的氯仿，之后剧烈摇晃。震荡，此时整个液体的颜色应该变成一种粉红色的。之后静置10分钟，静置后可以看到液体分层了。 12000转4度离心10分钟，可以看见液体分层很明显，最上面的是无色的水相，RNA就溶解在里面，中间一层是白色的固体，这层是蛋白质和DNA形成的复合体，下面是红色的酚相。把上层水相吸到另外一个管子里面，注意不要把下面的两层吸出来了，宁愿少一下没关系。 往水相液体中加入500ul的无水乙醇或者是异丙醇，上下颠倒混匀，此时如果RNA量多的话可以看见一些油一样的东西，反正就是感觉怪怪的那种，不过一般都不会出现明显的沉淀的。之后12000转离心10分钟，离心之后就可以看见管底有点半透明的东西了，那就是我们要RNA。倒掉无水乙醇或者异丙醇，加入500ul用DEPC处理水配制的70%乙醇，以洗涤RNA，加入后把管子敲一敲，尽量使RNA沉淀飘起来。之后在7500转离心8分钟，到掉乙醇，倒扣在干净的吸水纸上面，空气室温干燥，时间可以稍长点，40分钟到1小时，以看不见明显的液滴为准。干后用20ul或者30ulDEPC水溶解RNA，50度保温1小时。之后得到的R