PCR技术的原理与方法

PCR技术的原理和方法，钟昭帝，PCR定义、多形态发生(PCR)是分子生物学技术，在短期内大量扩增特定DNA片段。是指在DNA聚合酶的催化下，以母系DNA为模板，以特定引物为扩展起点，经过变性、退火、扩张等阶段，在in vitro中复制母系DNA互补子链DNA的过程。可以用于基因分离克隆、序列分析、基因表达调控、基因多态性研究等。PCR反应特性，特异性，简单快速，样品纯度要求低，PCR技术的基本原理，PCR的反应成分PCR反应的基本阶段PCR反应系统。PCR的反应成分，模板DNA引物4种DNA聚合酶反应缓冲液，Mg2，PCR反应的基本阶段，PCR反应的基本阶段变质：高温下双链DNA分解为单链(94，30s)退火：低温下底漆和DNA模板互补区域相结合(55，30s)膨胀：中温扩张，DNA聚合酶，PCR反应体系，10放大缓冲液1/10体积4种dNTP混合物，每种200umol/L引物(2个)0.2umol/L模板DNA 102 105 Taq DNA聚合酶1 2.5个单位/反应体系Mg2 1.5 ，PCR反应5元素，引物酶dntp(dgtp，dctp，dttp)模板(template)Mg2 (magnesium)，引物，引物是PCR特异性反应的核心PCR产品的引物设计的原则是在模板cDNA的保留区域设计引物长度最好。底漆长度一般在1530基底之间的底漆GC含量在40%60%之间，Tm值最好与72 底漆3末端。密码子的3 末端不能选择a。t在要随机分布碱基的引物和引物之间不能有互补序列。引物设计的原则，引物5端和中G值必须相对高，3端G值低的引物5端可以修改，3端不可修改的扩增产物的单链不能形成二级结构引物，酶及其浓度提供自然酶的TaqDNA聚合酶如下：从淑树菌中纯化基因工程酶。大肠杆菌合成典型PCR反应时，约2.5U(总反应体积为100ul时)的浓度过高，会引起非特异性扩增，浓度过低会导致合成物量减少，dNTP的质量和浓度，dNTP的质量和PCR扩增效率，DNTP与颗粒性密切相关。变质性失活用dNTP溶液以酸性保存使用后，用1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将pH值7.0 7.5，少量化妆，-20 冷冻保存。多次冻结可以使dNTP在PCR反应中分解，dNTP必须为50 200 umol/l，特别要注意，如果四种dNTP的浓度不同于不同的时间(高或低)，则可能会导致不一致。浓度低的话，PCR产品的产量dNTP可以与Mg2结合，降低自由Mg2浓度。模板(目标基因、目标gene)、模板核酸量和纯化程度是PCR成败的核心环节之一，传统的DNA纯化方法通常利用SDS和蛋白酶k消化标本SDS的主要功能是溶解细胞膜的脂质和蛋白质，因此溶解膜蛋白，破坏细胞膜，分解细胞核蛋白的SDS与蛋白质结合蛋白分解酶k沉淀消化蛋白质，特别是DNA和Mg2浓度，Mg2对PCR扩增特异性和产量有显着影响，在一般PCR反应中，多种NTP浓度为200umol/L时，MG2浓度为1.5 2.0 mmol/l适宜，反应性过高，非特异性扩增，浓度低，TaqDNA聚合酶活性降低，反应产物减少，pg2浓度为1.5 2.0 mmol/L。温度和时间的设置，变性-退火设置-在3个温度点标准反应中，使用3个温度点方法使双股DNA在90 95 中变性，然后快速冷却到40 60 ，将引物退火并结合到目标序列中，然后快速加热到70 75 ，TaqDNA聚合酶，变质温度和时间，变质温度低，解体人完全成为PCR失败的最大原因，通常在93 94lmin的情况下，模板DNA退化小于93的情况下，需要延长时间，但高温环境会影响酶活性，因此温度不能太高。如果不能完全变质目标基因模板或PCR产物，PCR失败，退火(复性)温度和时间，退火温度是影响PCR特异性的更重要因素，变质后温度快速冷却到40 60，因此底漆和模板可以结合。模板DNA比引物复杂得多，因此引物和模板之间的碰撞耦合机会远高于模板补充链之间的碰撞退火温度和时间。底漆的长度、基本配置和浓度、基于目标的序列的长度20个核苷酸的G C含量约为50%底漆，55 是开始最佳退火温度的理想场所，扩展温度和时间，扩展温度：一般在70 75 时常用温度为72 的膨胀温度对底漆和模板的结合效果不好。扩展反应时间：根据正在扩展的片段的长度，在1Kb以内的DNA片段，扩展时间为1min(足够)3 4kb的目标序列为3 4 min，扩展幅