PCR体系优化(新)

.,荧光PCR体系的优化及多色荧光PCR,程扬健,厦门大学生命科学院分子诊断实验室,.,.,什么是Ct值和Rn？,Ct值中的C代表循环数（Cycle），t代表域值（threshold），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Rn:相对荧光强度,.,为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量,.,实时荧光PCR是如何定量？,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,在一定范围:Ct值,.,PCR检测过程,RealtimePCR,.,实时荧光定量PCR优化目标,3、R值,.,优化内容,引物设计和筛选探针设计和筛选反应体系的优化反应程序的优化,HCV,分子信标,.,引物的设计与筛选1,序列查找与比对,.,附：主要数据库的网址,.,二级结构分析,条件：42；50mMNa+;2.5mMMg2+,/zukerm/rna/,引物的设计与筛选2,.,HCV5UTR,.,引物筛选结果,引物的设计与筛选4,.,引物用量的优化,不对称PCR（S/A=1：4）Vs对称PCR（S/A=1：1）,引物的设计与筛选5,.,探针设计和筛选1,探针设计,.,探针设计和筛选2,探针的Tm值,.,探针设计和筛选3,退火温度的确定,.,探针用量的优化,探针设计和筛选4,.,不同TaqE的比较,Taq1,Taq2,反应体系的优化1,.,TaqE浓度的优化,0.5U/T,1.0U/T,2.0U/T,3.0U/T,反应体系的优化2,.,dNTP浓度的优化,反应体系的优化3,.,Mg2+对荧光强度的影响,.,Mg2+和退火温度的优化-(方阵法）,.,PCR促进剂的影响,.,AMV与M-MLV的比较,.,M-MLV的用量的优化,.,高浓度RNA,低浓度RNA,比较了四个浓度：24U/T12U/T8U/T4U/T,RNA酶抑制剂浓度的优化,.,优化前后含量对比,.,逆转录时间的比较,逆转录时间（30min；45min；60min）,反应程序的优化,.,RT-PCR扩增程序优化,RT-PCR扩增程序（优化前）,42度，60分钟,95度，3分钟,95度，30秒,55度，20秒,逆转录,预变性,延伸,RT-PCR扩增程序（优化后）,42度，45分钟,95度，3分钟,95度，10秒,58度，45秒,逆转录,预变性,50个循环,45个循环,72度，20秒,退火,变性,退火延伸,反应程序的优化,变性,.,优化前后的比较,优化后,优化前,.,多色荧光PCR,双色荧光PCR三色荧光PCR多色荧光PCR,.,多色荧光PCR的特点,高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.经济性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.,.,双色荧光PCR,FA