专题课题多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

情境导引PCR诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术，它采用分子技术,模拟核酸在体内的复制，从而判,定疾病病原体的种类，所以从本,质上来说，这是一种分子诊断方法。,核心要点突破,知能过关演练,课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段,基础自主梳理,基础自主梳理,一、PCR扩增的原理及条件1概念：PCR即_，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2原理(1)DNA的热变性：在80100的温度范围内，DNA_结构解体，双链分开，这个过程称为_。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。,多聚酶链式反应,DNA,双螺旋,变性,(2)子链的合成：需要_；合成方向总是从子链的5端向3端延伸。3条件(1)_模板。(2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。(3)A、T、G、C四种_。(4)耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。(5)需要稳定的_和能严格控制_的温控设备.,引物,DNA,脱氧核苷酸,pH,温度,思考感悟1什么是引物？若要克隆DNA，应加入几种特定的引物？【提示】所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。,二、PCR反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为_、复性和延伸三步。1变性：当温度上升到_以上时，双链DNA解聚为单链。2复性：温度下降到_左右，两种引物通过_与两条单链DNA结合。3延伸：温度上升到_左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。,变性,90,50,碱基互补配对,72,DNA聚合酶,思考感悟2PCR循环过程中，变性温度设置95，时间设置30s的原因是什么？【提示】变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。,三、实验操作1实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控_，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个_代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行离心的场所。(3)微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。,温度,恒温水浴锅,2操作步骤准备_混合_反应。四、操作提示1为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行_。2所用的_和酶应分装成小份，并在20储存。五、DNA含量的测定1原理：利用DNA在260nm的紫外线波段的_曲线来测定相应含量。2计算公式：DNA含量(g)50(260nm的读数)_。,移液,离心,高压灭菌,缓冲液,吸收,稀释倍数,核心要点突破,1PCR扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,2PCR原理DNA的热变性原理通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。,3生物体内DNA复制与PCR反应的区别,(2011年聊城高二检测)下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是()ADNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链BDNA复制不需要引物C引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合DPCR扩增的对象是氨基酸序列【尝试解答】_C_,【解析】由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，故DNA复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA，而不是氨基酸。【探规寻律】(1)引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。包括引物和引物两种。用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。(2)细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分PCR反应需要可变的温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。,跟踪训练(2011年海淀区高二检测)关于DNA片段PCR扩增实验的描述中不正确的是()A加入的TaqDNA聚合酶耐高温B不同大小DNA在电场中迁移速率不同C此过程需要DNA连接酶D扩增区域由两种引物来决定,解析：选C。PCR扩增实验是在较高温度下进行的，故需要耐高温的TaqDNA聚合酶，但不需要DNA连接酶，A项正确，C项错误。因为不同大小的DNA带有不同数量的电荷，所以在电场中迁移速率不同，B项正确。PCR扩增需要两种引物，分别与DNA的两条模板链互补，则D项正确。,1反应体系的配方,2.实验用具(1)PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。,若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替，三个恒温水浴锅的温度分别为94、55和72，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL。(3)微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。,3实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照配方在微量试管中依次加入各组分盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁将微量离心管放在离心机上，离心约10min将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序,(2011年长春高二检测)多聚酶链式反应(PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸等。反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，故DNA数以指数方式扩增，其简要过程如图所示。,(1)某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基AGTC1234，则经过PCR仪五次循环后，将产生_个DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是_个。(2)分别以不同生物的DNA样品为模板合成的各个新DNA之间存在差异，这些差异是_。,(3)由于DNA分子上的“遗传因子”基本都是符合孟德尔的遗传规律的，因此人类可以利用PCR技术合成的DNA进行亲子鉴定，其原理是：首先获取被测试者的DNA，并进行PCR扩增，取其中一样本DNA用限制性核酸内切酶切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段分离，再使用特别的“探针”去寻找基因。相同的基因会凝聚在一起，然后利用特别的染料在X光下，便会显示由DNA探针凝聚于一起的黑色条码。每个人的条码一半与其母亲的条码吻合，另一半与其父亲的条码吻合。,限制性核酸内切酶能将DNA样品切成特定的小片段，这主要体现了酶的_。A专一性B高效性C多样性D作用条件温和2002年6月，我国第一张18位点的“基因身份证明”在湖北武汉诞生。人的“基因身份证明”是否终身有效？_，理由是_。,(4)请指出PCR技术与转录过程的三个不同之处：_；_；_。,【尝试解答】(1)326200(2)碱基(脱氧核苷酸)的数目、比例和排列顺序不同(3)A是因为同一个体的不同生长发育阶段和不同组织的DNA是相同的，所以它有高度的个体特异性和稳定性(4)PCR技术以DNA的两条单链为模板合成子代DNA，转录以DNA的一条单链为模板合成RNAPCR技术的原料为脱氧核苷酸，转录的原料是核糖核苷酸二者反应时的催化酶不同(或其他合理答案),【解析】本题考查了PCR技术的应用及相关计算与识图能力。(1)该DNA样品复制5次，产生DNA分子数为2532个，DNA样品中TA200个，则样品复制5次，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少为200(251)6200个。(2)不同生物的DNA样品中，脱氧核苷酸(碱基)数目、比例和排列顺序不同,故各个新DNA之间也存在差异。(3)限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定部位进行切割，这就说明酶具有专一性；人的“基因身份证明”是根据DNA上的遗传