组织制片技术概述

组织学光镜标本制作技术,人体解剖与组织胚胎学系孟运莲教授,一、组织学标本制作的意义和目的二、组织学标本制作的方法三、组织切片标本制作的基本程序四、苏木精伊红染色的程序,一、组织学标本制作的意义和目的组织学标本制作技术是随着生命科学的发展而不断进步的。利用组织切片和染色(staining)的方法所制出的标本显示了各种组织细胞的不同结构和形态，它们之间的相互连接及它们之中的某些化学成分的种类和含量的变化，为细胞分子学的研究提供了最直观的依据。因此，组织学标本制作技术是医学和生物学研究的一个最基本的手段。,二、组织学标本制作的方法,（一)组织切片法(二)非组织切片法,(一)组织切片法利用化学试剂将组织经过一系列的固定(fixation)、脱水、透明后，再利用石蜡或火棉胶和明胶等支持物渗透进组织内部，使组织保持一定的硬度，并包埋(embedding)成块，然后依靠切片机(microtome)将包埋好的组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。有石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片和冰冻切片等。,(二)非组织切片法有些软组织、硬组织或液态组织可以不经过切片而制成观察标本，如涂片、压片、铺片、磨片、消化分离、活体标本、整装标本和血管注射标本等。,涂片将所采的血液或骨髓样品涂抹于载玻片上经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。,压片先将组织处理成小块物质，然后经化学药品软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上的标本。例如运动终板等。,铺片将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成的标本。例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。,磨片骨和牙齿等硬组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上的标本。,消化分离将组织分离成小块，然后将其细胞间质消化溶解，再用机械分离的方法，如利用水的震荡冲击力等，使小块组织分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上封固。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。,活体标本将所采的观察标本加生理盐水后直接滴于载玻片上在显微镜下观察。整装标本一种是将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中。另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水和透明后封固于载玻片上的标本。血管注射标本一种是将有色物质注射进血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本。另一种是将有色物质注射进血管后，经一系列制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。,三、石蜡切片标本制作的基本程序取材固定固定后处理脱水透明包埋切片染色封固,（一）取材动物的处死处死动物要求手法迅速、快捷，避免动物因过度痛苦而产生组织细胞的变化。处死动物的几种常用方法：麻醉法、空气栓塞法、击头法、颈椎脱臼法、破坏脑和脊髓和股动脉放血。选择动物取材应根据实验工作的目的选择动物的种类，如猪的肝、猫的卵巢、狗的胃等；制作运动终板可用爬虫类动物如壁虎；观察间皮和内皮用蛙的肠系膜。选择取材部位如肥大细胞可取皮下组织；胰腺取胰尾部，脊髓的运动神经元取颈膨大和腰膨大处，肺取肺门，胃取胃底部,选择切面方向根据器官组织的结构特点选择切面方向，如肾脏宜在肾门处作纵切，头皮应顺毛根的方向纵切，大小肠的环行皱襞应纵切，气管和食管作横切比较适宜。应注意的问题组织新鲜注意环境温度的影响材料应小而薄151505厘米防止组织变形防止组织损害防止组织污染,（二）固定,固定的目的防止组织细胞产生自溶和腐败使细胞易于着色使组织适度硬化,固定的方法直接固定蒸汽固定灌注固定局部灌注固定全身灌注固定,局部灌注固定肾脏和肝脏可从其动脉注入固定液，同时剪断其静脉以利血液流出。眼球可从眼后房注入固定液。肺脏可从气管或支气管注入固定液。脑组织从颈动脉朝向头部方向进针注入固定液，同时剪开对侧颈静脉或左心房以利血液流出。经局部灌注固定的器官取下后应投入相同的固定液中进行后固定。,全身灌注固定较大的动物例如猫和狗等可采用全身输液的方法进行固定，方法是：动物经前期麻醉后，从一侧股动脉输入固定液，剪开另一侧股静脉以利血液流出，直至流出液为固定液时为止，动物灌注固定后取下的组织应用相同的固定液进行后固定1224小时。较小的动物如大白鼠和小白鼠等，用10%水合氯醛腹腔麻醉（亦可用乙醚吸入麻醉）后手术暴露心脏，剪开心包膜，在主动脉弓下穿进一根纱线备用，从左心室向主动脉弓方向进针，随即用穿好的纱线固定针头，剪开右心耳放血，先注入生理盐水，观察右心耳流出的液体成无色时，即可换成4%多聚甲醛溶液（用01MPB配制），约30分钟后停止。取下组织用4%多聚甲醛溶液后固定1224小时。,固定的注意事项固定剂的用量一般为组织块体积的15倍左右。固定剂的配制现配现用最为理想。固定的时间一般情况下固定24小时既可达到固定要求。,固定后处理,流水冲洗脱黄脱汞脱甲醛色素组织漂白脱钙（酸溶液脱钙、螯合脱钙、电解脱钙）,固定剂单纯固定剂甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、重铬酸钾、丙酮、铬酸、四氧化锇混合固定剂中性甲醛液、乙醇甲醛液、Bouin氏液、苦味酸硫酸液、Carnoy氏液、Helly氏液,甲醛(Formeldedhyde)固定浓度：4%水溶液（10%福尔马林）固定时间：12小时24小时固定后处理：流水冲洗12小时24小时配制方法：甲醛原液10ml生理盐水（或蒸溜水）90ml特性：甲醛原液浓度为40%。甲醛放置时间过长易产生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后变为甲酸，使溶液变为酸性，严重时可影响到细胞核着色。因此需长期保存的甲醛溶液应加入适量的碳酸镁或碳酸钙作为中和剂。酸性甲醛固定的组织易产生甲醛色素，固定后须用硷性溶液洗涤。,乙醇(Ethylalcohol)固定浓度：90%95%乙醇液固定时间：一般4小时12小时固定后处理：直接入脱水剂特性：乙醇易被氧化成乙醛继而变为醋酸，所以不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合。乙醇具有固定、脱水等多种功能，单独作固定剂使用时其渗透力较差，因此取材应薄，才能固定好。经乙醇固定的组织细胞核着色较差。高浓度乙醇（通常指90%浓度以上）不溶解细胞内糖原，宜做保存糖原的固定剂。组织在高浓度乙醇中放置时间过长时，收缩明显，易发脆，影响制片。50%以上浓度的乙醇可溶解组织内脂肪、类脂体、色素等，因此不能用作以上物质的固定剂。,中性甲醛液配制方法：40%甲醛120ml蒸馏水880ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠13g固定时间：24小时。固定后处理：流水冲洗24小时。适用组织：实验室常备固定剂，适用多种组织的固定。,乙醇甲醛液（AF液）配制方法：95%乙醇90ml40%甲醛10ml固定时间：组织块固定412小时，铺片固定510分钟。固定后处理：直接入脱水剂。适用组织：组织中的肥大细胞，组织化学中对糖原的固定等等。,Bouin氏液固定皮肤苦味酸硫酸液胚胎组织，尤以固定鸡胚最好Carnoy氏液糖原、染色体、尼氏体等Helly氏液骨髓、脾、肝等造血器官及胰岛、脑垂体前叶等含特殊颗粒的细胞,脱水的意义组织经固定和水洗后均含有大量的水份，水份不能与透明剂相溶，因此必须用某些化学试剂将组织块内的水份逐级逐步地置换出来，以利于透明剂渗入组织内。能置换组织内水份并能与透明剂溶合的化学试剂称脱水剂。脱水必须从低浓度开始逐级转入高浓度，最后转入透明剂中。脱水必须彻底，否则将会给以后的制片带来困难。但脱水又不能过头，特别是在高浓度脱水剂中浸泡的时间不能过长，否则会因为脱水剂对组织的收缩作用使组织变硬而脆化，也无法制出满意的切片。,（三）脱水,常用脱水剂脱水剂的种类很多，常用的有非石蜡溶剂脱水剂如乙醇和丙酮等，脱水兼石蜡溶剂的脱水剂有正丁醇和二氧陆环等。使用非石蜡溶剂脱水剂在脱水完成后必须经过透明剂透明后才能进入下一步。使用脱水兼石蜡溶剂的脱水剂在脱水完成后不必经过透明剂透明可直接进入下一步。两种透明剂各有优缺点，根据实验工作的需要选择使用，但经常使用的脱水剂是乙醇。,乙醇既是固定剂又是实验室常用脱水剂，脱水能力强，能与二甲苯等透明剂较好地混合。用乙醇脱水时遵循从低浓度向高浓度的梯度脱水原则。一般组织从70%浓度开始至无水乙醇，胚胎组织从30%浓度开始。组织在高浓度乙醇中停留时间不能过长，否则将会使组织脆化。丙酮沸点56，脱水能力比乙醇强，但对组织的收缩脆化作用也比乙醇强，因此主要用于组织的固定兼脱水或切片的快速脱水，以保护某些特殊染色的标本不被褪色。,正丁醇沸点100118，脱水能力较弱，但很少引起组织的收缩和脆化。因能与乙醇和石蜡混合，因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡包埋。脱水方法：组织块经固定洗涤后入50%、70%和80%乙醇中作基础脱水，然后转入正丁醇中脱水1224小时，再浸蜡包埋。,（四）透明,透明的意义透明是制作石蜡切片所必须的一个重要步骤，脱水后的组织块内部为脱水剂所占领，由于大多数脱水剂不能与石蜡混合，因此必须经过一种既能与脱水剂混合、同时又能与石蜡混合的“媒剂”的作用，这种媒剂称为“石蜡诱导剂”，它能逐渐渗入组织块内，最终将脱水剂从组织块中完全排出以利于石蜡渗入。这种“石蜡诱导剂”又称作透明剂，透明剂渗入组织后，组织块有光线透过，呈透明状态，透明剂渗入组织的过程称为透明。透明的时间根据组织块的大小、性质和透明剂的特性而定。,透明剂常用的透明剂有二甲苯、笨甲酸甲脂、三氯甲烷和冬青油等，以二甲苯最为常用。二甲苯为无色透明的液体，易挥发，长期接触对呼吸道粘膜有较强的刺激作用。二甲苯透明能力强。但组织在二甲苯中浸泡时间过长时较易发生过度收缩和脆化现象。用二甲苯透明时，小块组织20分钟至1个小时，大块组织可适当延长时间。如果组织块在透明时呈白色浑浊不透明状态时，则为脱水不彻底所致。此时应返回重新脱水。,苯甲酸甲脂为无色透明的液体，易挥发，透明能力强，对组织块的收缩和脆化的影响较小。透明时间12-24小时。组织块经各级乙醇至95%浓度脱水后可直接入苯甲酸甲脂透明。由于苯甲酸甲脂可溶解火棉胶，也可用于火棉胶切片的透明。三氯甲烷也称氯仿，无色透明的液体，极易挥发，透明能力较差，透明时间可长达24小时，但氯仿不易使组织收缩和变脆。目前广泛用于火棉胶胶块的透明。,（五）包埋,用石蜡做支撑剂将组织包埋成块使其硬化以利于切片的过程称作包埋。在石蜡包埋前还需一个浸蜡的过程。,浸蜡组织经过透明后，用石蜡作为渗入剂渗入组织内部以置换组织内透明剂的过程称作浸蜡。组织浸蜡的过程必须在恒温箱中进行。用于组织块浸蜡的石蜡分为低溶点蜡和高溶点蜡。低溶点蜡溶点在4850，也称软蜡；高溶点蜡溶点在6062，也称硬蜡。因此，浸蜡的恒温箱相应地分为软蜡箱和硬蜡箱两种：软蜡箱的温度控制在5254之间，组织浸蜡时间一般可达24小时；硬蜡箱的温度控制在6264之间，组织浸蜡时间一般不超过1小时。组织块浸蜡的成功与否与温度和时间有很大的关系，温度愈高，时间愈长，则组织块的收缩愈大，脆化愈明显。,包埋过程组织浸蜡完成后，接着进行组织块包埋。用于包埋的是硬蜡。使用前须在恒温箱中多次溶化，利用热胀冷缩的原理挤出原石蜡里的空气，再加入一定数量的（约十分之一）蜂蜡（或旧蜡）相混合，提高石蜡的密度和粘度，以使切片时便于形成完整的蜡带。蜂蜡也称黄蜡，是一种动物蜡，溶点约在54，粘滞度比石蜡高。组织块包埋一般采用包埋框来进行，包埋框由两块“L”型的金属框和一块金属底板相对拼合而成。包埋组织时应注意将组织块的切面朝下放平，包埋镊应加温后使用。组织包埋好后，应等石蜡凝固后才可将包埋框打开。修整蜡块时，组织块应距蜡块边缘23毫米，以利于连续切片。,包埋过程包埋石蜡；浸蜡石蜡；将组织块从浸蜡蓝中夹出来；将组织块置入包埋器中。,（六）切片,用石蜡作为包埋剂制作的切片称为石蜡切片，是组织切片中应用最为广泛的一种切片，其优点是易于制作大量菲薄的组织标本，而且石蜡包埋块又可长期保存。仪器及器材准备切片机；切片刀；恒温水箱式摊片仪；镊子；粘片剂；中号羊毫毛笔；经过清洁处理的载玻片等。,切片过程调节水温至47左右；固定蜡块；修整包埋面；调节切片厚度至46微米；切片；摊片；烤片。,切片的注意事项A切片前要将切片机各部位的螺丝旋紧，否则会引起切片机各部件震动，造成切片厚薄不匀；B组织块的切面和切片刀的倾斜度之间的夹角应按切片机刀台上的刻度作适当调整；C恒温水箱的温度应比包埋蜡的溶点低56；D环境温度高时蜡块容易变软，应使用冰块使蜡块的表面迅速冷却，以增加蜡块表面的硬度。,（七）染色,染料简介染料是指分子中含有发色团和助色团的有机化合物，有鲜艳的色彩，对于组织有极强的亲和力。根据来源可分为两类：天然染料（卡红、苏木精）人工合成染料（苦味酸、桔黄G）根据其化学性质分为：碱性染料(basicdye)酸性染料(aciddye)中性(neutrophilia)染料,金属染料是一种重金属盐，染色时金属微粒附着在细胞或组织表面呈棕黑色或棕黄色而显示其结构，如硝酸银、氯化金。在银染法中，有些组织可直接使硝酸银还原而显色，有些组织无直接还原作用，需加入还原剂后才能显色。可直接使硝酸银还原显色的称亲银性（argentaffin），需加入还原剂后才能显色的称嗜银性(argyrophilia)。脂肪染料能溶于适当浓度的有机溶剂并能被脂肪溶解从而使脂肪着色的染料，如苏丹系列等。荧光染料经过波长低于400nm的紫外线激发后能发出荧光的一类特殊染料，它们也都是具有生色团和助色团的酸性和碱性染料，在与组织细胞结合时，可使荧光紫外线转变成可见光，如吖啶橙、金胺-O等。,染色的原理,化学反应在组织细胞内一般认为都含有酸性物质和碱性物质。染色时酸性物质与碱性染料中的阳离子结合，碱性物质与酸性染料中的阴离子结合。在细胞核中主要由酸性物质组成（如核酸等），所以与苏木精等碱性染料有很强的亲和力。细胞质主要由硷性物质组成，所以与伊红等酸性染料有很强的亲和力。能被碱性染料着色的物质称为嗜碱性(basophilia)物质，能被酸性染料着色的物质称为嗜酸性(acidophilia)物质。,物理反应组织细胞有许多微小的毛细小孔，染料的色素离子通过这些毛细小孔渗入细胞内，这种渗入与细胞没有牢固的结合，但此时染料中分散的色素离子和组织细胞分子之间由于分子的相互引力作用，使色素离子被细胞的分子所吸附而使细胞着色。,染色的注意事项溶媒染料的溶媒主要选择蒸馏水和乙醇，因其不会影响染料的化学性质，并能增强染料的染色效果。浓度一般采用低浓度染液，较长时间浸泡的方法。如无特殊要求，一般染料的浓度为05%1%。温度温度增高能促进染料溶解，缩短染色时间，增强染色效果。金属染料金属染料浸染时（如镀金、镀银），必须使用经过清洁处理的玻璃器皿并避光染色。石蜡切片染色时必须彻底脱蜡否则会影响细胞着色。,媒染剂、促染剂和分化剂的应用媒染剂凡能增强染料对组织的着色能力，其本身又能与染料或组织发生结合的化学试剂称为媒染剂。如配制各种苏木精染色液时添加的钾明矾、铵明矾等。促染剂能增强染料对组织的着色能力，但本身并不参与染色反应。如伊红染色液中添加的冰乙酸等。分化剂能除去组织上和切片上过染的染色液，使受染的部位与周围组织对比鲜明，着色深浅适当，更便于观察细胞的结构。分化剂又分为酸性分化剂，例如低浓度的盐酸，醋酸等。氧化分化剂例如高锰酸钾，重铬酸钾等。媒染分化剂如铁明矾等。,（八）封固,组织切片制片的最后一道程序是滴加封固剂，用盖玻片复盖于载有组织片的载片上，以利于镜下观察，并借以阻断组织片与外界的接触，从而防止组织片脱片、受潮、干裂、