病毒基础知识讲座(二)

第三，病毒学的发展过程病毒性疾病的病原研究阶段；病毒化学和结构的研究阶段。(一)病毒性疾病的病原研究阶段从发现病毒到20世纪30年代早期，病毒学研究集中在：分离和鉴定引起各种病毒性疾病的病毒；病毒对机体的特定病理作用；病毒的传播方式和受感染宿主的范围；各种物理和化学因素对病毒感染的影响等。在发现这种病毒的那一年，德国细菌学家列夫勒和弗罗什于1898年证实了口蹄疫病毒的存在。1911年，劳斯发现了劳斯肉瘤病毒(RSV)，它能引起鸡的恶性肿瘤。从1915年到1917年，托特和德赫勒分别发现了噬菌体。通过过滤试验，人们先后发现了近百种病毒病，包括流感、脊髓灰质炎、几种脑炎、狂犬病、兔粘液瘤、马铃薯花叶、曲叶病、条纹病、黄瓜花叶、小麦花叶等。此外，人们从解决疾病的角度出发，在有机体水平上研究了病毒的症状、传播途径、传播介质和繁殖特征。黄热病于1899年在古巴流行，细菌学家里德证明罪魁祸首确实是埃及伊蚊。后来日本的高木证明了叶蝉可以传播水稻矮缩病，蚜虫可以传播马铃薯退化病。300多年前(1619年)已知的郁金香花叶病直到1929年才被证明是由蚜虫传播的。在此期间，发现了一些非常有趣的病毒生物学现象，如病毒突变产生不同致病力的菌株。此外，同一病毒的不同毒株之间存在拮抗作用，这被称为干扰现象。其他人发现，在将患病植物的汁液注射到动物体内后，动物血清和患病汁液会产生特定的反应。这些研究成果对当时病毒性疾病的预防和治疗起到了重要作用。在这个阶段，人们对病毒本质的理解仍然很肤浅。他们认为病毒是一种类似细菌的病原体。不同的是，病毒只能在活细胞中繁殖，体积很小，在显微镜下看不到，可以通过细菌过滤器。这就是为什么这种病毒在那个时期被称为“超微过滤病毒”。(二)病毒的化学和结构研究阶段1935年，美国生物化学家斯坦利发现烟草花叶病毒的传染性被胃蛋白酶破坏了。受这一现象的启发，他几乎碾碎了数吨感染了花叶病毒的烟草，并试图通过酶提取来纯化病毒。他拿了一把显微镜下看起来像针状晶体的小勺子。将晶体放入少量的水中，水就会发出乳白色的光。用手指触摸溶液，在健康的烟叶上摩擦几次。一周后，烟草也染上了同样类型的花叶病。可以看出，纯化的物质确实是一种传染性烟草花叶病毒。今天，在美国加州大学的斯坦利实验室里，仍然有一个标有“Tob”的瓶子。莫斯。其中含有当年第一个纯化的烟草花叶病毒。根据各种测试结果，证明这种结晶物质是蛋白质。初步的渗透压和扩散测试表明，这种蛋白质的分子量高达几百万。其结晶产物的传染性取决于蛋白质的完整性，传染性被认为是病毒蛋白质的一种特性。斯坦利的研究论文发表在1953年的科学杂志上，他在论文中写道：“烟草花叶病毒是一种具有自我催化能力的蛋白质，它的增殖需要活细胞的存在”。在TMV结晶后的近20年里，许多其他病毒相继结晶。1955年，斯卡弗和施韦特成功地结晶了脊髓灰质炎病毒，这是第一个结晶的动物病毒。然而，斯坦利在他的结晶工作中没有注意到病毒的含磷成分。1936年，巴登和皮里等。在纯化的TMV中发现含磷和含糖成分，以核糖核酸的形式存在。通过热变化，这种核酸可以从病毒颗粒中释放出来。斯坦利很快也证实了这一发现。斯坦利和他的同事证实了几种不同植物病毒的核酸也可以从核蛋白中分离出来。TMV的结晶及其化学本质的发现是对医学和生物科学的重大贡献。它不仅引导人们从分子水平理解生命的本质，而且为分子病毒学和分子生物学的诞生奠定了基础。鉴于斯坦利对TMV研究的杰出贡献，他于1946年被授予诺贝尔奖，这是第一位获得这一荣誉的病毒学科学家。最初从电子显微镜照片上看到的病毒是一些几乎相似的粒子。1939年，甘什在电子显微镜下直接观察到了烟草花叶病毒，指出烟草花叶病毒是一种长杆状颗粒，直径为1.5纳米，长度为300纳米，而番茄黄花叶病毒颗粒为球形，直径为25纳米。早期电子显微镜学家最令人兴奋的发现之一是噬菌体，即dHerelle的噬菌体，它在第一张电子显微镜照片中引起了巨大的轰动。噬菌体非常小，只有10纳米大小，但它们具有高度有序和复杂的结构。它们有一个圆形的头和最初被认为是尾巴的附属物，就像小蝌蚪一样。经过多年的争论，已证实噬菌体的附属物不具有运动功能，但它在噬菌体吸附于细胞表面和将感染性核酸注射入细胞中发挥了重要作用。在病毒学研究的化学阶段，仍有一些相对重要的进展。施莱辛格在1934年获得了纯化的噬菌体，艾尔福德在1938年测量了各种病毒的颗粒大小。然而，一般来说，病毒学家使用敏感动物(如小鼠)或动物胚胎(如鸡胚)来研究病毒，并在此阶段分离和鉴定了近100种病毒。同时，在生物水平上研究了病毒的繁殖、致病机理和免疫反应。这只是微生物学的一个分支。与此同时，对病毒化学本质的理解相对肤浅。虽然病毒学在这一时期取得了很大的进步，但它还没有形成一门独立的学科。关于它仍然有很大的争论和意见。(3)细胞水平时期的病毒研究这一时期包括20世纪40年代至60年代。在这一时期，病毒学在理论和实践上都取得了很大的进步，逐渐形成了一门独立的学科。由于在此期间对病毒的化学性质有了更清楚的了解，对病毒的概念也更加统一和清晰。1.利用大肠杆菌来研究噬菌体的感染过程已经取得了迅速的发展。由德尔吕克和好时公司领导的“噬菌体小组”对噬菌体和被感染的细菌细胞之间的关系进行了大量深入的研究。这一时期的突出贡献是德尔吕克在1940年阐明了噬菌体的复制周期。1950年，勒沃夫揭示了溶源性噬菌体诱导的原理。1952年，好时公司证明了噬菌体DNA的传染性。1952年，辛德发现了噬菌体的转导现象。1952年，厄尔曼发现了溶源性噬菌体。2.组织培养技术已经应用于动物病毒的研究。早在1943年，中国学者黄就用鸡胚组织块进行病毒传代、定量滴定和试管中和试验。中国已故微生物学和病毒学奠基人高尚银院士在1958年国际病毒学研讨会上宣读论文培养脓细胞的组织培养方法研究，开启了中国昆虫病毒学研究的新篇章。利用这一新技术，许多学者先后分离出数百种过去对动物不敏感的新病毒，如腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、Echo病毒和柯萨奇病毒，大大拓宽了病毒学研究的范围。组织培养技术不仅发展了临床病毒学，而且可以用来研究病毒的复制和遗传，使人们对病毒的本质有了进一步的了解。1949年，恩德斯成功地利用单层细胞培养繁殖了脊髓灰质炎病毒，并因其对脊髓灰质炎病毒的开创性研究而获得1954年诺贝尔奖。1952年，杜尔贝科用细胞单层培养进行空斑试验；1953年，索尔克用细胞培养的脊髓灰质炎病毒制备灭活疫苗；1957年，斯图尔特用细胞培养技术分离多瘤病毒。目前，组织培养技术已广泛应用于未知感染因子的分离、病毒疾病的诊断、疫苗的生产以及病毒感染和复制的基础研究。组织培养技术对动物病毒研究的贡献主要包括：发现病毒转录和翻译的新途径；通过病毒选择宿主范围；一些肿瘤病毒引起的细胞转化；某些病毒感染引起的细胞融合；一些病毒核酸被发现由几个片段组成。有些病毒核酸具有不同的极性，例如，小核糖核酸病毒是正链核糖核酸病毒，正棒病毒是负链核糖核酸病毒。3.植物病毒有了重要的发现。例如，1952年哈里斯揭示了TMV外壳蛋白的化学性质，1955年弗伦克尔康拉特成功地将TMV核酸及其蛋白亚基改造成受感染的TMV，1956年弗伦克尔康拉特也证明了TMV-核糖核酸分子具有传染性，1956年安德勒阐明了TMV外壳蛋白变性的可逆性。1960年，铁杉确定了烟草花叶病毒外壳蛋白的氨基酸序列。中国农业大学邱院士对北京大白菜和华北小麦矮秆三大病害进行了深入研究。(4)分子病毒学研究时期自1953年DNA双螺旋结构理论建立以来，由于分子生物学的迅速发展和新技术、新方法的应用，病毒学研究进入了分子病毒学的发展时期。50-60年代是分子生物学的基础时代，病毒，尤其是噬菌体和植物病毒，对此做出了巨大贡献。因此，分子病毒学是在分子生物学的发展过程中出现的。分子病毒学的发展是分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和病毒学理论与技术等相关学科相互渗透的结果。特别是，分子生物学新技术的发明极大地刺激了分子病毒学的发展。分子病毒学的发展经历了以下过程：1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构理论，使人们开始从分子水平理解遗传物质DNA的结构基础和复制特征，并理解基因表达和性状之间的关系，从而为分子生物学和分子病毒学的建立奠定了基础。1962年，卡西尔阐明了许多病毒的二十面体结构，并确定了病毒核衣壳二十面体的组成规则，这是理解病毒超微结构的一个重大突破。1962年，拿但斯在体外成功翻译了噬菌体核糖核酸。1965年，斯皮尔曼成功克隆了噬菌体核糖核酸；体外。1967年，勾连在体外成功复制了X174噬菌体。这些工作对阐明脱氧核糖核酸病毒和核糖核酸病毒的繁殖机制起到了重要作用。1967年，迪那发现了一种类病毒。当他试图分离马铃薯纺锤块茎病病毒时，他发现其病原体不是病毒，而是分子量约为105的裸核糖核酸，没有蛋白质。如此小的核糖核酸分子不编码任何蛋白质。迪那根据其特殊性质，将这些致病因子称为“类病毒”。随后的研究表明，病毒样核糖核酸有一种特殊的复制机制。类病毒的发现是分子病毒学史上的一件大事。它不仅揭示了自然界中比病毒更简单的生物的存在，而且加深了人们对生命起源的理解。在类似病毒的报道之后，在澳大利亚发现，类似病毒的环状核糖核酸分子也可以与病毒基因组核糖核酸一起被包裹在核糖核酸病毒颗粒中，从而给绒毛烟草、三叶草和三叶草带来疾病。其中，病毒样核糖核酸被称为“病毒样”。瘙痒最初被认为是由类病毒引起的。普鲁辛纳在1982年证实羊瘙痒因子不是一种类病毒，而是一种分子量仅为3.0104的蛋白质，称为“蛋白质感染因子”或“朊病毒”。根据类病毒的发现，拉夫(1981)首次提出了将病毒分为真正的病毒和类病毒的概念。随着假病毒和朊病毒的相继发现，类病毒、假病毒和朊病毒在1983年意大利“植物和动物亚病毒病原体：病毒和朊病毒”国际研讨会上被列为亚病毒。1968年，杜斯伯格发现了流感病毒的多片段核糖核酸基因组。随后，在诸如呼肠孤病毒和大麦条纹花叶病毒的其它病毒中也发现了病毒基因组分割现象。1970年，杜勒格发现劳斯肉瘤病毒含有致癌基因v-src，在正常鸡、其他脊椎动物和无脊椎动物的DNA中也发现了致癌基因v-src的同源序列，表明病毒致癌基因来源于细胞的正常基因。随着其他肿瘤病毒癌基因的发现、肿瘤病毒细胞培养体系的建立以及肿瘤病毒对细胞转化诱导作用的测定，人们对肿瘤发生的机制有了更深入的了解。1970年，提明和巴尔铁莫分别发现了该病毒的逆转录酶。逆转录酶基因组RNA在逆转录酶的作用下，首先合成原病毒DNA，然后将原病毒整合到宿主染色体DNA中。除了病毒致癌基因外，原病毒插入和整合到宿主DNA中也会引起细胞致癌基因的激活和细胞转化。逆转录酶和反转录酶的发现是对克里克1958年遗传中心法则的重要补充和发展，该法则表明遗传信息不仅可以从核酸中获得，也可以从核酸中获得。1971年，限制性内切酶技术的发现为DNA序列分析和病毒基因定位创造了条件。利用这项技术，我们成功地构建了乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒和疱疹病毒的限制性内切酶图谱。其他新技术，如基因转移方法和Southen blot的诞生，也加速了定位病毒特异性基因，尤其是转化基因，以及分析病毒核酸序列的过程。此外，20世纪70年代出现的DNA重组技术使得一些病毒基因组能够克隆到原核细胞中的质粒载体上，并在细菌中获得大量的复制和表达产物，从而促进了对病毒基因组结构和功能的研究。1977年，剑桥大学的桑格完成了X174-DNA全序列的测定，为此桑格第二次获得诺贝尔奖。根据X174-DNA序列的分析结果，桑格意外地发现了基因重叠。随后，在诸如R17、MS2、F2和Q的DNA噬菌体中也证实了基因重叠的存在，这是病毒利用有限的遗传信息来执行更多功能并提高其在进化过程中的适应性的表达。1977年，周立泰澄清了腺病毒转录过程中的剪接现象，随后在SV40和多瘤病毒中发现了转录后的剪接过程，从而证实了真核基因的不连续性，澄清了内含子和外显子的概念。1978年，菲尔斯和雷迪确定SV40-DNA的一级结构由5224个碱基对组成。SV40是第一个完整核苷