HPLC手性固定相法在体内药物分析中的应用

.,HPLC手性固定相法在体内药物分析中的应用,.,手性药物（chiraldrug）,药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有所差别，分别被命名为R-型（右旋）或S-型（左旋）、外消旋。,.,.,手性分子：组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体。分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手性结构。根据对偏振光的作用不同可分为R、S体两者的等量混合物称之为消旋体。,.,.,手性药物药效学差异,两种对映体具有相同或相近的药理活性异丙嗪：抗组胺；普罗帕酮：抗心律失常。一种对映体具有药理活性，另一种活性弱或无活性非甾体抗炎药物的-芳基丙酸类化合物，如萘普生、布洛芬等。两种对映体药理活性相似，但反应强度不同代表药物：抗癌药环磷酰胺，S-对映体活性是R-对映体的2倍。两种对映体具有不同的药理活性作用于不同的靶器官、组织而呈现不同的作用模式。代表药物：索他洛尔，S-对映体阻断作用R-对映体抗心律失常作用,.,手性药物药效学差异,两种对映体的作用相反如：异丙肾上腺素（1-受体激动剂）R-(-)-：受体激动作用S-(+)-：受体拮抗作用一种对映体具有药理活性，另一种具有毒性作用氯胺酮为中枢性麻醉药物，只有(S)-(+)-对映体才具有麻醉作用，而(R)-(-)-对映体则产生中枢兴奋作用。镇静药沙度利胺（反应停），(R)-对映体有镇静作用，(S)-对映体及其代谢产物有严重的胚胎毒性和致畸作用。对映体的作用互补性左旋多巴酚丁胺-受体激动剂作用，对-受体的作用弱右旋体为-受体激动剂，而对-受体的作用弱外消旋体给药能增加心肌收缩力，但不增加心率和血压。不同的作用靶点表现不同的特性药物作用于不同的组织（靶点、受体）呈现不同的特性，这类药物往往是多功能的，作用是多方面的。,.,反应停事件,.,手性药物的药代动力学,吸收被动吸收：手性因素无影响。主动转运和易化扩散：可能发生对映体间的竞争性相互作用和吸收的变化分布手性药物对映体竞争性的与血浆蛋白、酶或受体结合，都可引起对映体间相互作用及其在分布上的改变。代谢相互抑制作用：对映体竞争同一代谢酶，会发生对映体间的相互抑制。单向抑制作用：如果一个对映体是另一个对映体的代谢抑制剂，则会发生单向抑制作用。排泄肾脏排泄的立体选择性主要表现在肾小管分泌、主动转运和肾代谢过程，导致对映体间发生相互作用。,.,1992年美国食品与药品监督管理局（FDA）提出发展单一对映体生产计划和对映体药物纯度的鉴定规定后，如何能快速而准确的分离和测定手性药物已成为医药界关注的重大课题。,.,手性药物拆分方法,利用物理性质溶解度、吸附力等的差异，如：结晶法、色谱法等；利用反应速度差异的动力学拆分法；利用酶的高度特异性的催化反应的酶拆分法,.,手性药物色谱法拆分,超临界流体色谱法（SFC）气相色谱法（GC）高效液相色谱法（HPLC）高效毛细管色谱法（HPCE）,.,手性HPLC法,间接法（CDR）柱前衍生化法，手性试剂衍生化法（CDR），将具有高光学纯度的手性衍生化试剂（CDR）反应引入第二个手性中心，形成非对映异构体，可在普通固定相上实现分离测定。直接法手性选择剂键合到固定相表面或加入流动相中，药物对映体通过与手性选择剂形成的暂时的非对映络合物的能量差或稳定性不同而达到分离的目的。手性固定相法（CSP）手性流动相法（CMPA）,.,手性柱的分类和应用举例,-氢键型键合固定柱将有光学活性的有机小分子通过一定间隔基键合到硅胶柱上。以Pirkle型应用最为广泛。分离原理在与溶质间的n-n相互作用，氢键作用和偶极-偶极作用。Pirkle型手性固定相通过链烃基将手性有机小分子链接到硅胶载体上制得。含端羧基或异氰酸酯基的手性基团的化合物与氨基键合硅胶进行缩合反应分别形成含酰胺型或脲型结构的手性固定相。,.,手性柱的分类和应用举例,-氢键型键合固定柱例：韩海等4用Pirkle型SumichiralOA手性柱对体内D-酸性氨基酸进行了拆分测定，并建立了快速分系统，用本系统对免疫功能低下的老年病小鼠动物模型快速老化小鼠亚系1(SAMP1)进行分析发现了其胸腺和脾脏中D-天门冬氨酸的含量较对照组同龄抗快速老化小鼠亚系1(SAMR1)有显著升高趋势。,.,手性柱的分类和应用举例,含肽或蛋白质键合相将蛋白质、酶和抗体等生物大分子键合到硅胶，可用于分离酸类、胺类、-氨基酸类药物。例：用T1-酸糖蛋白(T1-acidglycoprotein,AGP)Chiral-AGP柱顾景凯等对口服给药后兔血浆中新抗炎镇痛剂SFZ-47()-3H-1,2-二氢-2-(4-甲基苯胺基)-甲基-1-吡咯里嗪酮对映异构体进行了分离测定，两种异构体得到较好分离，血浆中(-)-SFZ-47对映体浓度始终高于(+)-SFZ-47,说明(+)-SFZ-47体内优先消除。王晓琳液相色谱法对注射及口服布洛芬精氨酸之后布洛芬对映体进行分离。房晶等测定了苯磺酸左旋氨氯地平血药浓度。,.,手性柱的分类和应用举例,含肽或蛋白质键合相CHIROBIOTICV手性柱糖肽类抗生素（万古霉素）键合在硅胶上，由于万古霉素结构特点使柱子具有手性的氢键结合部位、肽键结合部位和碳水化合物结合部位，可与被分离物质发生静电作用、包合作用、偶极叠加作用、电荷转移作用、形成氢键和立体排斥等作用，可采取正相、反相和新极性有机相分离，对胺类、中性酰胺、脂类有很好的立体选择性例：有报道9-11用于血浆中布洛芬,卡维地洛对映体,氯胺酮对映体等分离测定。,.,手性柱的分类和应用举例,含碳水化合物的手性固定相包括醋酸纤维素、其他纤维素衍生物（如环糊精、冠醚）和直链淀粉等。纤维素-三苯甲酸酯涂敷在氨丙基硅烷化硅胶上便得到CTB固定相,.,手性柱的分类和应用举例,含碳水化合物的手性固定相微晶纤维素+异氰酸苯酯纤维素-三苯基氨基甲酸酯三苯基氨基甲酸酯涂敷在氨基键合的硅胶上CTPC,.,手性柱的分类和应用举例,含碳水化合物的手性固定相微晶纤维素+3，5-二甲基苯基异氰酸酯纤维素-三35-二甲基苯基氨基甲酸酯纤维素-三35-二甲基苯基氨基甲酸酯15%的量涂敷在氨丙基硅胶上CDMPC-CSP,.,手性柱的分类和应用举例,含碳水化合物的手性固定相-环糊精（CD)手性固定相，CD与硅胶上不水解的硅烷链相连，CD分子呈锥筒状洞穴，大小有CD环大小决定，洞穴内为疏水性缩醛氧原子，洞穴外沿为亲水性羟基，对映体以能否进入洞穴形成包合物及紧密程度，产生不同的保留时间从而得到拆分。,.,手性柱的分类和应用举例,含碳水化合物的手性固定相举例周婕等用12新型键合直链纤维素衍生化合物手性固定相ChiralpakIC色谱柱(50mm4.6mm,5m)，流动相正己烷异丙醇-二乙胺(80:20:0.1),流速0.8mL/min，检测波长273nm，柱温25,血浆中西沙必利对映体能够完全分离，分离度1.65，其血浆提取回收率达87%，线性范围为10160g/mL，最低检测限为5g/mL，RSD4.0%。张亮等14以ChiralpakAD-RH(4.6mm150mm,5m)色谱柱，10mmol/L硼砂缓冲液(0.1%三乙胺，pH9.0)-乙腈-乙醇(50:25:25)为流动相分离普萘洛尔对映体，检测波长为229nm,研究普萘洛尔对映体及其外消旋体经大鼠皮肤渗透的对映体选择性。结果萘洛尔对映体在21min内完全分离(分离度Rf=2.2),在3200g/mL内线性关系良好。ChiralpakAD还用于建立了血浆中奥美拉唑对映体的分析方法15。,.,手性柱的分类和应用举例,配体交换相将手性配体通过各种间隔基与硅胶键合，属亲水性固定相。通过一个金属离子与一个配体分子和一个对映体溶质分子结合成可逆的非对映体而达到分离。例：苏丹等16用Phenomenexchirex3126配体色谱柱，对肌肽对映体进行了拆分。,.,手性柱的分类和应用举例,其他类型的手性柱分子印迹聚合物手性固定相（MIP-CSP）分子印迹聚合物(MIPs)通过分子印迹技术合成的对特定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物。MIPs发挥特异性识别作用的关键是其具有能与模板分子及类似物的官能团相结合的特殊空穴17。MIP-CSP依靠拥有对印迹单对映体立体结构具有记忆功能的结合位点来进行手性识别的，利用与不同对映体吸附作用的差异实现拆分。核酸类手性固定相寡糖类的手性固定相等,.,手性柱(商品柱）Chiralcel柱类型与应用,.,手性柱（商品柱）,AstecCYCLOBOND系列(键合环糊精手性柱),手性、非手性选择性，可与LC-MS兼容；AstecCHIROBIOTIC系列(大环糖肽型手性柱),可用于含水和非水流动相，特别适用于极性和可电离化合物的分离；AstecCelluloseDMP系列(纤维素型手性柱),适用于正相、极性有机和SFC模式；AstecP-CAP和P-CAP-DP系列(多环胺聚合物手性柱),溶剂范围广；AstecCLC(CopperLigandExchange)系列(配位交换型手性柱),用于分析非芳香有机酸、氨基酸、胺类等物质,.,自制柱用于手性药物体内分析,举例周仁丹等20采用对硝基苯氨基甲酸酯衍生化6-叠氮基-环糊精，将衍生化的配体与含炔键的SBA-15硅胶进行点击反应(Clickchemistry)，合成新型对硝基苯氨基甲酸酯化-环糊精键合SBA-15硅胶手性固定相(NPCSP)。在极性有机溶剂模式下，成功实现了人血浆中-受体阻滞剂普萘洛尔对映体的快速手性分离。杨沛等21通过在不同粒径的氨丙基硅烷化的硅胶(APS)上涂敷具有手性识别的纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(CDMPC),制备出了纤维素衍生物类的手性固定相(CSP),采用高效液相色谱法在合成的CSP上进行了-受体阻滞剂(普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔)的手性拆分和对映体的含量测定并测定了血浆中普萘洛尔。罗迎彬等22用含不同取代基的苯甲酰氯修饰壳聚糖4种新的衍生物，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将壳聚糖衍生物涂敷于大孔的3-氨丙基硅胶上，制得相应的手性固定相，结果表明以上固定相均有较好的对映体选择性。,.,其他,非手性-手性HPLC法，先用非手性HPLC法使样品中内源性杂质与待测物分离,收集对映体流分，再用手性HPLC法对对映异构体进行分离测定。采用柱切换方式，先经过预处理柱去除干扰，被测物留在预柱上，通过柱切换将留在预柱上的组分冲洗到分析用手性柱上进行拆分测定。联用技术直接检测器法，手性旋光检测器（ORD)，圆二色检测器，测定平面偏振光通过光学活性物质时,由于左、右旋圆偏振光的传播速度不同致二者的吸收差异性，其与液相色谱联用,通过康顿效应的正负来宏观标识手性对映体,.,手性固定相法优缺点,优点能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定；除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂；样品处理步