免疫测定方法学和临床应用PPT课件

.,1,免疫测定方法学临床应用,.,2,免疫分析技术简介乙肝病毒标志物定性、定量检测常见问题抗HCV检测问题ANA.ENA检测问题TP-Ab检测问题TB-Ab检测问题,免疫测定方法学临床应用,.,3,免疫分析技术,早期的免疫分析技术:免疫扩散、免疫电泳、直接及间接血凝、被动血凝、补体结合实验特点:这些检测方法成本低、结果易于判断、技术上便于掌握,但不便于免疫检测自动化后来的免疫分析技术:放射性核素标记、荧光免疫标记、酶免疫标记、稀土元素标记及化学发光分子标记特点:快速、灵敏、特异、易于测定等实验室的免疫检测自动化奠定了基础,.,4,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,TherapeuticDrugs,ThyroidHormone,FertilityHormone,Allergy,CancerMarkers,InfectiousDisease,Vitamins,SerumProteins,免疫分析技术,.,5,放射免疫的创立,1959美国Yalow第二代试剂除上述C100抗原外又加上了HCV核心区多肽C22-3和非结构区抗原C33C。较第一代试剂检出率提高25-30%,抗体出现提早到16-60天。,丙肝病毒抗体,.,29,不足：由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽,所以仍存在抗-SOD造成的假阳性问题,于是激发人们建立人工合成肽段检测抗-HCV的新试剂。,丙肝病毒抗体,.,30,第三代抗-HCV检测系统,核心区抗原比例相对下降,而相应也增加了NS3区C33C的比例,优化了试剂盒的组装工艺；利用现代基因重组技术,对一些重要抗原采用更好的表达、纯化系统,利用先进的生产工艺、使包被抗原的活性更强,增加了检测的灵敏度,减少了非特异性反应；加入了NS5区抗原。,丙肝病毒抗体,.,31,目前我国多采用第三代抗-HCVELISA试剂,其敏感性超过99%,虽然目前缺乏判断其敏感性的金标准,但对于免疫功能正常的HCVRNA阳性感染者,抗-HCV检出率也高于99%。,丙肝病毒抗体,.,32,补充/确认实验:重组免疫印迹(RIBA),检测原理：以待测血清中的HCV抗体和分别固定在硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜等载体上的不同HCV抗原之间的特异性结合反应为基础,测定待测样品中抗-HCV的存在和有无。,丙肝病毒抗体,.,33,因为HCV的各种抗原分别被单独固化在载体的不同位置上,因此,该项检测可以区分待测样品对HCV不同抗原的不同反应。目前RIBAHCV已经得到FDA的认可,成为抗-HCV确认的标准。临床意义：RIBA阳性的患者中75-80%为病毒血症(HCVRNA);RIBA阳性而血清中没有HCVRNA时提示可能为既往感染。,丙肝病毒抗体,.,34,实时荧光监测PCR检测原理：在PCR扩增反应管内加入了标记有两种染料的针对靶序列的探针,每当一次扩增反应中一条探针与靶序列退火结合后,整个反应体系就会增加一个单位的荧光.从而得出每一次扩增循环结束后产物的量.,丙肝病毒抗体,.,35,临床意义：特异性强：抗-HCV阳性并不能代表现症感染,丙型肝炎的诊断标准是HCV-RNA.敏感性高：可发现抗-HCV阴性者HCV感染.阳性出现早：在“窗口期”没有抗-HCV产生,但可检测出RNA.可指导用药：为疗效观察及预后判断提供指标.,丙肝病毒抗体,.,36,与HBVDNA相比，HCVRNA检测更为复杂和困难,检出率低:血清中病毒含量低,且有一定波动,呈间歇阳性;易被RNA酶降解;HCVRNA受进食的影响,HCV易与血中脂质及脂蛋白结合,致使其检出率降低;二次PCR,其中任何步骤的问题均易影响其检出。,丙肝病毒抗体,.,37,应用EIAS/CO比值报告抗-HCV结果,试剂Ortho3.0华大吉比爱金伟凯华美科化英科新创万泰,S/CO比值3.87.010.06.010.08.610.0,阳性预测值96.1%96.1%96.1%97.3%96.0%96.1%96.0%,任芙蓉,等.中华肝脏病杂志,2005,13:255-258,丙肝病毒抗体,.,38,抗-HCV筛查检测,报告,阴性,或,根据S/Co比值判定为阳性,所有阳性结果,高S/Co比值阳性*,报告,低S/Co比值阳性*,RIBAHCV检测,或,阳性,报告,阴性,报告,不确定,报告,阳性,阴性,RIBAHCV检测,HCVRNA的检测,阳性,报告,阴性,报告,不确定,报告,报告,*以S/Co3.8(OCDHCVELISA3.0)或8.0(OCDVITROSECi/ECiQHCV)为“界值”。,CDC抗-HCV实验室检测结果报告导则,丙肝病毒抗体,.,39,ANAENA测定,目前临床应用检测自身抗体的主要免疫学试验技术种类有：间接免疫荧光法（indirectimmunefluorescence,IIF）、直接免疫荧光法(IF)、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹技术、乳胶颗粒凝集、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫检验和酶免疫细胞化学等。其中，IIF法、免疫印迹法和ELISA法被广泛用于临床检测直接抗细胞成份和可溶性细胞成份抗体的检测。有时为了弥补试验技术或试剂中可能存在的缺陷以及试验条件的影响，提高试验结果的特异性和敏感性，也用一种方法检测多种自身抗体，或一种自身抗体用多种试验方法检测。,.,40,ANA.ENA-Abs,.,41,欧蒙斑点法(EuROAssAY),实验原理将膜条上平行包被数种纯化的、已鉴定生化特性的抗原线作为固相。象固定生物薄片一样将膜条固定在载片的反应区。若是阳性，已稀释血清中的特异性抗体将与固相上的抗原结合。第二步，碱性磷酸酶(AP)标记的抗人抗体与已结合的抗体反应。第三步，加入可产生颜色反应的色原底物溶液温育。若标本中含有待测的特异性抗体，相应的抗原条带将呈现较深的颜色。,ANA.ENA-Abs,.,42,结果判断简单，可靠不需特殊仪器，肉眼判断结果由于把抗原包被在固定的位置判断实验结果比免疫印迹法简单，更适合常规检测反应区的质控带呈显较深的颜色反应说明操作正确。阴阳性结果差别明显。条带显色的深浅与抗体滴度相关。抗原经亲和层析分离纯化。膜条上没有多余蛋白，不会产生非特异性反应。反应过的载片可长期保存，试验结果容易存档。,ENA多肽抗体谱（欧蒙斑点法）,ANA.ENA-Abs,.,43,ENA多肽抗体谱（免疫印迹法）,ANA.ENA-Abs,.,44,需注意问题,(1)同一批号NC膜与同一批号标准带相比：了解了NC膜制备可知只有同一批号才有比较价值，因在一次电泳中各种ENA抗原泳动位置相同，不同批号时因每每电泳条件不可能完全一致而没有可比性；电泳中蛋白质迁移率衡定，各种蛋白质先后顺序衡定，但各蛋白质之间距离(mm)因每次电泳条件不同而有变化。(2)标本膜条“O”线与标准带“O”线对齐：有时病人血中仅含有一种单抗原区带显色的ENA抗体甚或一种非特异显色区带，如果没有将“O”线对齐，12mm的偏差就会误判为另一种ENA抗体或误为非特异显色而报出错误的报告。,ANA.ENA-Abs,.,45,关于标准带的误差,理论上同一分子量的蛋白质在一次电泳中泳动速度是一致的，从“O”线至电泳位置的距离是一样的；实际上，一整块聚丙酰胺凝胶电泳时虽蛋白质同起于“O”线，但两边蛋白质因各种因素的作用而速度有变，使在整块凝胶上两边蛋白质呈一条弧线，厂家在切制NC膜条时应将周边误差部分切除，但有时仍有余留。这余留部分就会造成标准带的误差，检验人员在观察结果时应注意这一问题。IBT同ELISA都是通过酶标记显色判断结果，有关试验注意事项有很多类同：洗涤液要洁净，有霉菌等污染时非特异显色；清洗要彻底，以防显色底色过深影响结果判断；IBT的显色液(-氨基联苯胺)与ELISA的显色液(TMB或OPD)完全不同，不能将显色液混用或替代。,ANA.ENA-Abs,.,46,梅毒螺旋体(TP),梅毒的病原是苍白螺旋体(TP)，感染后患者血清学反应较复杂，可产生2种抗体，一种是梅毒螺旋体非特异性抗体；另一种是TP特异性抗体。目前常用的抗TP特异性抗体试验有：梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、TPPA、FTA-ABS、ELISA。这些方法敏感性和特异性都较高，而FTA-ABS是诊断梅毒的血清学金标准，但受到一些条件的限制不容易普及。ELISA和TPPA是国内使用主要方法。常用的抗TP非特异性抗体试验有甲苯胺红不加热血清试验(TRUST),梅毒螺旋体.TP,.,47,梅毒螺旋体非特异性抗体与TP特异性抗体检测的关系,螺旋体进入人体后可产生很多抗体，这些抗体可以是针对梅毒螺旋体不同成份的。梅毒的体液免疫反应有下列表现：（1）特异性抗体：二期梅毒病人血清