宏者礼品公司简介

宏基因组学的一般研究策略摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略Strategies for accessing metagenomics for desired applicationsAbstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field.Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%1。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用2。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。1 宏基因组学研究策略1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的3, 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究4。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。1.2 微生物及其基因的富集在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果5 ，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常图 1 环境微生物宏基因组学研究策略6 Fig. 1 General process of metagenomic strategie6用的就是上面例子中的底物选择法5。每一个事物都有其两面性，富集培养虽然扩大了基因的总量，却很容易使部分微生物及其携带的基因丢失。基因水平富集中的稳定同位素探针技术(SIP)很有代表性, 它是用稳定同位素标记底物, 用相对量较大的原子掺入到具有活性的核酸里,采用密度梯度离心法将其分开, 标记的核酸可作为PCR的模板,用来构建宏基因组文库7。目前，SIP与宏基因组学结合的报道还不多，但其潜力与优势很明显，利用SIP可提高新基因发现的几率。 1.3 环境中总DNA的提取宏基因组学要分析的样品成分复杂,要获得高浓度、大片段、无偏好的总DNA是宏基因组学技术的难点，也是其重点。现在提取DNA的方法大体有两种: 其一是直接提取法, 又称原位提取法，它用化学和物理方法直接裂解样品中的微生物使DNA得以释放,再抽提总DNA,并对 DNA进行纯化。其中以Zhou法8和Tsai9法最为常用。该法操作简便、省时、成本低,能代表某一生境的微生物群落多样性。其缺点是会出现细胞裂解不完全或 DNA 与样品杂质共沉淀而难以分离, 故一般要再进行DNA纯化这一步,它所提取的DNA片段较小(1 kb50 kb), 适合小片段文库的构建; 其二是间接提取法, 即异位提取法,是采用差速离心等方法将细胞从样品中分离出,再提取DNA, 该法获得的DNA纯度高、DNA 片段大(20 kb500 kb), 适合构建大片段的基因文库。但操作繁琐、成本高、DNA 产率低且有偏嗜性, 其产率只是上一种方法的1%10% 10, 其总DNA往往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。可见两种方法各有利弊，应根据具体实验灵活选择，一般较好提DNA的液体样品才用后者。本实验室通过实验研究得出：一般而言，直接裂解提取法效率较高, 不易丢失物种信息，能够获得 25 kb 左右的 DNA 片段。间接法提取效率较低, 容易丢失基因信息。因此我们建议采用直接提取法获取总DNA。我们还采用低熔点琼脂糖包埋法提取水样中的大片段DNA，其大小在50Kb以上。单一包埋块中的DNA含量较小，我们把多个琼脂糖包埋块放在一起后用酶法纯化浓缩，大大提高了DNA的总量，收到了很好的效果。1.4文库的构建1.4.1载体的选择: 现在用于DNA克隆的载体有质粒、Fosmid、Cosmid、BAC、YAC和噬菌体等，可由DNA纯度、片段大小、质粒特性、宿主菌及筛选方法等灵活选择。质粒可用于克隆小于10kb的DNA片段，对较大的基因或由多基因簇构成的DNA可以建立Fosmid文库11-13和 Cosmid 文库14。BAC和YAC的容量可达200 kb450 kb 15。但YAC载体存在着比较高的嵌合体(占全部克隆的40%60%),转化效率低,稳定性差,插入片段分离与纯化比较困难15。BAC、PAC、MAC和人类人工染色体HAC等载体系统克服了以上缺点。一般认为BAC是其中较好的。Fosmid 质粒上带有 E.coli F 因子单拷贝的复制原点和需诱导的高拷贝 oriV 复制原点，其表达受一个严谨条件诱导的启动子的控制。我们可通过诱导Fosmid阳性克隆高效表达的方法获得大量质粒，便于提取功能DNA，进而进行序列和酶学特性的分析，而不需要再建亚克隆。我们通过大量实验摸索出了Fosmid质粒的较佳的应用条件，其效果优于其它载体。1.4.2 宿主细胞的选择: 不同种类的微生物所产的活性物质不同。选择宿主时应考虑转化效率的高低、重组载体的稳定性、外源基因能否有效表达、目标性状是否缺陷等。目前， E. coli 是应用最多的宿主16.17, 其背景清楚、操作简单、繁殖快、易培养。为了表达真核外源基因我们实验室改进了酵母和CHO等表达系统且效果明显，它们是表达真核修饰蛋白（如市售的很多药物蛋白）的重要研究方向。现在有人利用链霉菌、假单胞菌等作为表达新抗生素的宿主效果较好18。我们可根据目的产物不同灵活选择宿主菌，一般而言，若要开发新型生物催化剂则用E. coli19，若开发的是新的抗生素等药物则选择亲缘关系很可能较近的链霉菌等。1.5文库的筛选活性克隆子的筛选是宏基因组学技术的又一重点和难点。高通量的筛选策略能否应用成功是实验成败的关键。由于生物的个体性很强，导入宿主菌的基因可能缺乏有效的转录、翻译以及蛋白转运分泌机制,也可能由于翻译后加工机制不完善,或宿主缺乏必要因子及存在密码子的偏嗜性等将直接影响筛选的效率和灵敏度20，给宏基因组文库筛选带来了很大的挑战。目前筛选策略主要有一下两种：1） 基于序列的筛选方法，该法用到了生物信息学，由已知的同源性很近的基因的序列设计探针或PCR引物,再用杂交或PCR扩增等技术筛选出目的基因, 该法是筛选保守性较高的生物催化剂的有效方法。它克服了功能筛选法中对活性产物的有效表达的依赖。其中PCR 扩增技术是最常用的21。这一方法是根据保守和已知DNA序列设计的,所以它的缺点是被筛选出的新基因总是与已知基因相同或类似,或扩增的特异性不强，筛选效果不理想，且难以获得完整的功能基因。现在基因芯片技术和优化的随机鸟枪法筛选效果也很令人信服。序列依赖性筛选法被看作是极具潜力的一种筛选方式。很多研究者在此方面作了改进，譬如应用穿梭载体表达外源基因，从而使宏基因组DNA 利于通过多种宿主进行筛选，或者对大肠杆菌做适当修饰以增加基因表达的范围。2) 基于功能的筛选方法，这一种方法利用外源基因表达产物的活性来筛选阳性克隆,即采用各种活性检测手段挑选有活性的克隆子,进而对其进行研究分析。现在大部分的新型生物催化剂都是利用这种方法筛选得到的。人们已经在选择性平板上筛选到了脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及抗菌活性的克隆子22,23。本方法中有一种有效的筛选方式是构建报告融合子24,可将提取的总DNA随机克隆到无启动子的绿色荧光蛋白基因(GFP)前面, 运用荧光激活细胞分离(FACS)技术, 在添加特定底物的情况下富集筛选阳性克隆。但该法依赖于基因的高效表达，产物有的要求较高的活性，其缺点是工作量大、效率低下, 被转化的宿主仅在少数有可见性状。最近关于底物诱导基因表达检出法的报道也不少25。在实地实验中常常将上面两种方法结合起来，既避免了功能筛选鉴定不出的难表达序列，又避免了序列筛选的不足26。2 宏基因组学的主要应用(图2)及其研究进展2.1发现新的基因 我们对自然界中99%以上的微生物知之甚少, 因此构建的宏基因组文库中新基因种类的数量极大。如, Tyson 等人对一个群落结构较简单的嗜酸生物膜的宏基因组进行了测序, 从76 Mbp 中鉴定出的新基因超过了4 000个27。利用宏基因组文库, 已发现的新基因主要有生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白的基因28-30等。2.2 开发新的微生物活性物质 宏基因组学技术为新的微生物活性物质的开发提供了新思路。已被广泛用于开发不可培养微生物中有商业利用价值的生物催化剂。宏基因组技术与定向进化技术(如定点突变、DNA改组)结合可以获得更适于商业应用催化剂。该策略克服了发酵限制等传统缺点。携带载体的宿主可通过基因工程地方法强化其表达产物，通过增加克隆表达强度，高效筛选感兴趣的宏基因组片段及其产物。目前，通过宏基因组技术从环境中已经筛选出多种酶如转移酶类、水解酶类 、乙醇脱氢酶类、淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、酯酶、脂肪酶、木聚糖酶、新的抗生素和抗菌抗肿瘤活性物质( 如紫色杆菌素) 及抗生素抗性基因( 如 N-酰基酪氨酸合成酶基因)31等。这些酶可适应于较低的温度与较大的ph值范围32，因此是商业用酶的首选。将宏基因组文库筛选和基因改组等基因工程技术结合起来, 在开发新的微生物活性物质方面潜力巨大。2.3微生物分子生态学研究 宏基因组学技术为认识由可培养和不可培养微生物所构成的复杂生境提供了新思路。因此也提出了环境生物宏基因组的概念。它使得研究者可绕过细菌分离培养这一步,而从基因水平进行微生物分子生态学研究。从环境中提取DNA,再通过图2宏基因组学的应用7Fig.2Application of the metagenome7PCR等方法获得各种细菌rDNA,测序后进行系统学分析,即可描述环境微生物的遗传多样性,使人们对大量不可培养的微生物群体有了全新的认识37。例如Tyson33等研究了生长在流动的酸矿外排液表面的嗜酸生物膜的群落结构及其代谢途径, 从中鉴定出了5个基因, 并由微生物之间的基因的功能互补揭示了它们的碳氮固定和产生能量的代谢过程和这些微生物在极端环境中的生存策略17。宏基因组扩大了生态学研究的对象,随着分子生物学技术的进步,以功能基因为基础的功能生态学将成为未来的热点，这才是真正意义上的微生态32。2.4生物降解作用研究微生物是适应环境能力最强的物种, 环境污染往往伴随微生态的变化34,35。宏基因组技术可以研究不可培养微生物，发掘它们的基因资源，获得具有某些物质降解能力的活性物质，进而了解特定环境下微生物或活性物质的耐受机理，用于污染的修复。如，我们可建立污染地域的宏基因组文库，筛选具有某污染物降解能力的克隆再用遗传工程手段，把从宏基因组中分离出的基因组编成具有其他活性成分、或可降解污染物功能的基因簇用于污染物的处理。Kube36等建立了黑海海床的Fosmid文库，筛选到了厌氧环境下苯甲酸盐类降解相关酶的基因，经过生物信息学分析后，完成了苯甲酸盐的厌氧代谢通路，并找到了控制此过程的关键基因。可见本技术对解决三废问题，实现可持续发展有一定的意义。3 结语与展望 宏基因组学作为一门新兴学科，展示出强大的生命力与潜力，越来越多的科研人员将眼光投向它，其重心也从多样性分析转移到活性物质的筛选上来37。虽然该技术在应有上硕果累累。但由于它刚刚起步,还有些技术方法不够成熟。主要有三方面38-43，一是DNA 的提取方法需进一步完善，外源基因表达量少和缺乏高效的筛选方法。二是对更适宜的载体的探索真核表达宿主细胞的开发，研究和探索多种真菌宿主势在必行。三是需要把宏基因组学与生物信息学和生物芯片技术等结合起来，生物信息学为宏基因组复杂的序列信息的分析提供了方便。如芯片技术已用于检测微生物群落的基因表达。随着文库构建和筛选策略的不断提高, 异源基因表达能力和产量的增加, 宏基因组学技术将成为研究环境微生物多样性, 筛选新的功能基因和生物活性物质的重要手段，它的前景是很诱人的，相信经过我们不断的摸索与创新，并结合现在先进的仪器与技术，它将会发展成为生物学中璀璨的一颗明珠，更好的发挥出它应有的潜力。参考文献：1李丽娟,张殿昌,龚世园.宏基因组技术在开发未培养微生物资源中的应用J.水利渔业,2007,27(3):7-9.2丁维俊,董婷,曾庆秋.从宏基因组学谈中医整体观的现代化J.四川中医,2008,26(6):26-28.3 Suzan Pantaroto de Vasconcellos , Clio Fernando Figueiredo Angolini , Isabel Natalia Sierra Garca, Bruna Martins Dellagnezze , Cynthia Canedo da Silva , Anita Jocelyne Marsaioli , Eugenio Vaz dos Santos Neto , Valria Maia de Oliveira. Reprint of: Screening for hydrocarbon biodegraders in a metagenomic clone library derived from Brazilian petroleum reservoirs. Organic Geochemistry 41 (2010) 1067-10734 Venter JC, Remington K, Heidelberg JF, et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science, 2004, 304(5667): 66-74.5 Schloss PD, Handelsman J. Biotechnological prospects from metagenomics. Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(3):303-310.6 黄循柳，黄仕杰，郭丽琼，林俊芳 宏基因组学研究进展 微生物学通报 2009, 36(7): 1058-10667 Jeon CO, Park W, Padmanabhan P, et al. Discovery of a bacterium with distinctive dioxygenase that is responsible for in situ biodegradation in contaminated sediment. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(23): 13591-13596.8 Kavita S. Kakirde, Larissa C. Parsley, Mark R. Liles. Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics. Soil Biology & Biochemistry 42 (2010) 1911-19239 Nicola Segata1, Jacques Izard, Levi Waldron, Dirk Gevers, Larisa Miropolsky, Wendy S Garrett and Curtis Huttenhower. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biology 2011, 12:R610 Daniel R. The Metagenomics of soil. Nature Reviews Microbiology, 2005, 3(6): 470-478.11 Park HJ, Jeon JH, Kang SG, et al. Functional expression and refolding of new alkaline esterase EM2L8 from deepsea sediment metagenome. Protein Expression and Purication, 2007, 52(2): 340-347.12 Lee DG, Jeon JH, Jang MK, et al. Screening and characterization of a novel fibrinolyticmetalloprotease from a metagenomic library. Biotechnol Lett, 2007, 29(3):465-472.13 Jin D, Lu W, Ping SZ, et al. Identification of a new gene encoding EPSPS with high glyphosate resistance from the metagenomic library. Curr Microbiol, 2007, 55(4):350-355.14 Xu MX, Xiao X, Wang FP. Isolation and characterization of alkane hydroxylases from a metagenomic library of Pacific deep-sea sediment. Extremophiles, 2008, 12(2):255-262.15 朱雅新, 王加启, 马润林, 等. 荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因 BAC 文库的构建与分析. 微生物学报, 2007,47(2): 213-216.16 Wang C, Meek DJ, Panchal P, et al. Isolation of poly-3-hydroxybutyrate metabolism genes from complex microbial communities by phenotypic complementation of bacterial mutants. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(1):384-391.17 Ono A, Miyazaki R, Sota M, et al. Isolation and characterization of naphthalene catabolic genes and plasmids from oil-contaminated soil by using two cultivation independent approaches. Appl Microbiol Biotechnol, 2007,74(2): 501-510.18 Martinez A, Kolvek SJ, Yipc LT, et al. Genetically modified bacterial strains and novel bacterial artificial chromosome shuttle vectors for constructing environmental libraries and detecting heterologous natural products in multiple expression hosts. Appl Environ Microbiol, 2004,70(4): 2452-2463.19Lammle K, Zipper H, Breuer M, et al. Identification of novel enzymes with different hydrolytic activities by metagenome expression cloningJ. J Biotechnol, 2007, 127(4):575592.20 Bell PJ et al. Microbiology, 2002, 148: 2283-229121 He YZ, Fan KQ, Jia CJ, et al. Characterization of a Hyperthe-rmostable Fe-superoxide dismutase from hot spring. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(2): 367-376.22 P.K. Siddhapura, S. Vanparia, M.K. Purohit, S.P. Singh. Comparative studies on the extraction of metagenomic DNA from the saline habitats of Coastal Gujarat and Sambhar Lake, Rajasthan (India) in prospect of molecular diversity and search for novel biocatalysts. International Journal of Biological Macromolecules 47 (2010) 375-37923RondonMR, AugustPR, BettermannAD, et al. Cloningthe Soil Metagenome: a Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured MicroorganismsJ.Applied and Environmental Microbiology,2000,6(66):2541-2547.24Amann RI,LudwigW,SchleiferKH.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivationJ.Microbiol Rev,1995,1(59):143-169.25钱莉莉,陈少欣,史炳照.宏基因组学在新型生物催化剂开发中的研究进展J.微生物杂志,2006,26(4):68-71.26欧敏功,崔晓龙,李一青.宏基因组学在未培养微生物研究中的应用J.微生物学杂志,2007,27(2):88-91. 27 TYSON J W.Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment J.Nature, 2004, 428: 37- 43.28 VENTER J C.Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso SeaJ.Science, 2004, 304: 66- 74.29 DANIEL R.The metagenomics of soilJ.Nature Review Microbiology, 2005, 3: 470- 478.30 RIESENFELD C S, GOODMAN R M, HANDELSMAN J.Uncultured soil bacteria are a reservoir of new antibiotic resistance genesJ. Environmental Microbiology, 2004, 6: 981- 989.31 LAMMLE K, ZIPPER H, BREUER M, et al.Identification of novel enzymes with different hydrolytic activities by metagenome expression cloningJ.Journal of Biotechnology, 2007, 127: 575- 592.32Arnaldo Glogauer, Viviane P Martini, Helisson Faoro, Gustavo H Couto1, Marcelo Mller-Santos Rose A Monteiro, David A Mitchell, Emanuel M de Souza, Fabio O Pedrosa and Nadia Krieger. Identification and characterization of a new true lipase isolated through metagenomic approach. Microbial Cell Factories 2011, 10:5433Brady S F, Chao C J, Handelsman J, et al. Cloning and heterologous expression of a natural product biosynthetic gene cluster from eDNAJ. Org Lett, 2001, 3:1981-1984.34 WENDEROTH D F, FERSLEV B, MACARRI G, et al.Leitbakteria of microbial biofilm communities causing occlusion of biliary stentsJ.Environ Microbiol, 2003, 5: 859- 866.35 SCHMEISSER C, STOCKIGT C, RAASCH C, et al.Me