118第十八章_转基因动物48张幻灯片.ppt

1,第十八章转基因动物第一节转基因动物的原理定义：转基因动物是指以人工方法导入外源基因，在染色体内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,2,自1980年Gordon等将猿猴病毒SV40和人单纯疱疹病毒的tk基因整合后注入到小鼠受精卵原核中，首次成功地培养出转基因小鼠后，已先后有牛、羊、猪、兔、鱼等转基因动物出生。目的主要是基因工程育种；改变动物的基因组组成，以获得各类疾病模型；将动物做为分子工厂，生产对人类有价值的产品等。,3,转基因动物是实验动物学与分子生物学紧密结合的成果，是在胚胎和重组DNA技术发展的基础上产生的。能在生物体中接近真实地再现某一特定基因的表达和所导致的后果，把复杂系统简化进行研究，是目前层次最高的实验体系。,4,建立转基因动物模型，研究外源基因在整体动物中的表达调控规律，能够观察基因调控的整体效应。近十年来，转基因动物已被广泛应用于脂蛋白代谢紊乱与动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的病因、发病机理及治疗等方面研究，取得了令人瞩目的研究成果。,5,人类疾病造模,动物模型对疾病产生机理和治疗是必不可少的工具利用转基因动物可以创造出多种动物模型转基因动物用于发病机理研究的例子：AD对AD患者死亡后脑部解剖发现脑部存积了一种淀粉状蛋白的蛋白质将人类淀粉状蛋白的基因转到大鼠体内使其发病，再清除淀粉状蛋白，发现确实能够减慢甚至停止病情。,6,第二节建立转基因动物的方法1目的基因的设计在进行转基因动物研究时，首先要针对实验目的设计待转移的目的基因。基因可以是单一基因，也可来自于不同基因（拼接基因）。从结构上看，待转基因可分为结构基因与调控序列两部分。,7,拼接基因应用更为广泛，可通过选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性。进行基因剔除的转基因动物研究时，首先要设计与待剔除基因的同源性的载体基因，包括正负选择标志基因，通过同源重组（同源取代或同源插入）而使目的基因失活，从而建立缺基因动物。在进行基因设计时，还应设计相应的检测方法，必要时设计一个报告基因（reportergene）。,8,2载体的选择运用转基因动物研究基因表达，特别是在研究遗传性疾病和进行基因治疗时，选择合适的基因载体是十分必要的。有关实验表明，载体的DNA序列可能干扰外源基因的表达。,9,最早用于哺乳类细胞表达载体的病毒是转化型DNA病毒，如SV40和腺病毒。这些载体的主要缺点是对外源DNA容量太小，只能携带约78kb的外源序列，因此这类载体不可能表达许多与疾病有关的功能基因。,10,与其他载体相比，从鸟类和鼠类中获得的逆转录病毒是目前应用广泛的一类最有前途的载体。这类病毒是经过改造的缺陷病毒，如通常使用的禽白血病病毒和罗氏肉瘤病毒。这类病毒载体能有效地把外源基因导入哺乳动物靶细胞，其整合方式在结构和功能上较稳定，功能基因插入和表达很容易。,11,为避免逆转录病毒启动子干扰和携入诱变的可能性，许多研究者还构建出一类已被剪除了自身启动子和增强子序列的逆转录病毒。这类失活载体只表达由外源基因携带的启动子起始的载体编码序列。,12,3转基因方法用于转基因动物研究的基因转移方法有多种，其中较常用的三种方法有显微注射法、逆转录病毒感染法和胚胎干细胞法。,13,显微注射法是直接将重组DNA分子以微注射的方式导入单细胞卵的原核中，再将它植入假孕母鼠。大约20%的微注射胚胎能够将外源基因整合到染色体基因组上；大多数转基因动物能够将整合的基因传给后代，建立起转基因鼠系。,14,一、DNA显微注射技术,2003JohnWileyandSonsPublishers,优缺点：1.可靠性高、重复性好2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高3.导入DNA片段的大小和类型不受限制4.转基因在代与代之间传递的稳定性好5.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响6.可能会出现不希望的插入突变7.开发装置和技术的花费大时间长,1980PNAS77,7380-7384,15,显微操作仪,16,逆转录病毒感染法是用高滴度的、携带外源基因的重组逆转录病毒感染发育早期的胚胎，再将感染病毒后的胚胎植入假孕母鼠，以产生转基因的动物。逆转录病毒的整合并不影响宿主DNA序列的重排。,17,四、逆转录病毒介导的基因转染,缺点：低拷贝数需要逆转录病毒插入DNA大小有限可能产生不希望的重组高频的镶嵌现象逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,61486152,18,从ES（胚胎干细胞）细胞到转基因动物是从哺乳动物胚胎中分离出ES细胞，通过转导或转染的方法，将外源基因转入ES细胞，再以微注射的方式将其植入受试动物的胚胎。,19,上述三种方法各具有优缺点。显微注射法相对整合率较高（1%10%），操作简便，易于获得成功。但外源基因通常以多拷贝串联的形式随机整合于受体基因组中，这种异常排列可能妨碍其表达的正常调节。,20,逆转录病毒感染法的外源基因通常是单位点、单一拷贝整合，从而保证了外源基因结构的完整性。但整合效率较低，而且操作比较繁琐，能被导入的基因大小有一定限制（通常为10kb左右）。,21,显微注射法等传统的转基因技术具有随机性和不可预见性，外源基因的拷贝数和整合位点都是随机的，还可能出现嵌合体，整合率极低，得到的转基因动物数量更少，据统计从1989年至1997年用显微注射技术生产转基因动物平均51.4个动物才得到一个转基因后代。,22,5转基因动物模型的建立新出生的转基因动物通过点杂交、聚合酶链反应（PCR）和免疫印迹杂交（Southern、Northernblotting）等方法，先筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后分别在mRNA和蛋白水平上检测外源基因在子代转基因动物中的表达情况，对外源基因表达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转基因动物的生理功能和是否出现某些疾病症状的表型等。进一步培育和筛选出转基因动物的纯合子。,23,转基因动物的一般制备过程。,24,转基因动物的一般制备过程（续）。,25,1982年美国哈佛大学的一个小组，将大鼠的生长激素（rGH）基因与小鼠的金属硫蛋白（MT）基因的启动子顺序连接，再引入质粒中。把这种重组的质粒注射入小鼠受精卵中，经过充分发育后分娩出了21小鼠，其中有七只带有融合基因，六只生长迅速，每只体重平均可达44g，超过同窝无融合基因小鼠（平均体重29g）的1.5倍，这就是闻名于世的“超级小鼠”。,26,带有人生长激素基因的转基因小鼠,正常小鼠,27,2000年，法国科学家利用转基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改造后，使它的发光率提高了两倍，再将该基因转入到兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。在普通光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的光线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。,28,理想的光源：萤火虫荧光素酶（luciferase）,标记癌细胞,标记细菌,标记转基因鼠,29,生物发光,标记基因,物理学成像,软件数据分析,30,LivingImage成像及数据分析软件,31,通过观察发育过程中,VEGFR2-Luc转基因小鼠的VEGFR2表达逐渐降低,研究生物体发育过程,信号强度,32,VEGFR-2在伤口愈合过程中的诱导表达,生物发光强度,33,第三节转基因克隆动物动物转基因技术面临着一些问题，诸如生产效率低，基因整合效率不高，生产周期长，成本高，转基因动物死亡率高，常出现不育导致转基因难以传代，无法大规模生产。,34,动物克隆技术属于无性繁殖范畴，能实现基因型复制，使少数优秀个体迅速扩大成群。转基因克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其研究意义和实用价值又超过了两种技术。它以转基因细胞为核供体，采用体细胞核移植技术产生转基因克隆动物，实现种质创新。,35,转基因克隆动物技术显示出的优势：1、生产效率高相比用显微注射技术生产转基因动物平均51.4个动物才得到一个转基因后代，而得到一个转基因克隆后代只需20.8个母体。,36,2、周期短，成本低通过核移植克隆迅速产生大量同质的转基因克隆动物，转基因克隆技术在理论上，只需一代时间，就可以产生一个完整的转基因克隆动物系，从而节约了时间和成本，由于植入代孕母畜的全是转基因胚胎，因而提高生产效率，降低费用。,37,3、可以决定后代性别以生物制药为目的的转基因克隆动物，生产中，性别是相当重要的，例如需要用雌性生产乳汁。由于选择体细胞作为供体，可以预先决定性别。,38,英格兰罗斯林研究所（Roslin）1997年10月宣布成功克隆出携带有人凝血因子X基因的绵羊早期胎儿成纤维细胞，以该细胞系为核供体移植到去核卵母细胞中，经过处理后，将卵母细胞植入假孕绵羊体内发育，获得3只绵羊。这3只绵羊能高水平表达人凝血因子X（125g/ml）。这一研究展示了转基因克隆动物技术的可行性。,39,转基因动物技术可用于改造动物的基因组，使家畜、家禽的经济性状得到改良，例如使生长速度加快、瘦肉率提高，肉质改善，饲料利用率提高，抗病力加强等。结合体细胞克隆技术能使优良种畜迅速扩群，在短时间培育出新品种。,40,转基因动物可生产药用蛋白通过家畜乳腺分泌人体药用蛋白，一直是转基因动物研究的热点。从1987年Gordon等人在转基因小鼠乳汁中得到人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA），到现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达，这些蛋白可以治疗人类相关疾病。,41,生物药物生产,主要通过乳腺生产（动物乳腺生物反应器），少数通过肾脏和膀胱。1999年，只有三种产品进入临床实验；到2004年，已经有40多种进入临床实验或进入市场。,2005DDT10,757-767,42,前景,转基因动物制药（乳腺生物反应器）是21世纪生物医药产业的一种新的药物生产模式。美国红十字会预测：到2010年，转基因动物生产的商品将达到350亿美元的销售额，生产的药物将占整个基因工程药物的90%以上。,43,44,通过转基因动物可以生产进行器官或组织移植时所需的器官和组织。例如人们发现胎儿神经细胞可用于帕金森症治疗，但由于伦理道德的原因，这种移植组织难以得到。研究表明，家畜胚胎神经细胞可以替代人类神经细胞用于帕金森症的治疗。,45,人体移植器官短缺是一个世界性难题，研究