基因工程研究生课程班

基因工程,GENETICENGINEERING,中山大学中山医学院生物化学教研室杨霞yangxia,重组DNA技术的发展史,年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉,相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组DNA技术与医学的关系,本节主要内容,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）,DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的分离获得某一感兴趣的基因或DNA获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(geneticengineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,基因工程,将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为重组DNA技术或分子克隆技术。,人类胰岛素,干扰素,得到纯系转殖菌株,基因工程药物,（二）工具酶,限制性核酸内切酶DNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,BamH,GCAATGCTTAGCCAT,CGTTACGAATCGGTA,核酸外切酶,核酸内切酶,核酸外切酶,GCAAGCTTTAGCCAT,CGTTCGAAATCGGTA,限制性核酸内切酶,AGCT,AGCT,AGCT,AGCT,AGCT,NNNNN,NNNNNNNNNNNNNNN,NNNNNNN,NNNNNNNN,NNNNNNNNN,NNNN,NNN,Alu,限制酶概念提出的背景20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。1962年，WArber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶.,EcoliK株噬菌体,EcoliK株,其他Ecoli菌株,限制现象,限制性内切酶,能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。,NNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNN,BamH,5,3,NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNN,Alu,5,3,作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类、（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,BamH,+,Bst,同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。,BamH,Bgl,+,+,（三）目的基因,研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。,目的基因,需要克隆的DNA片段。,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,目的基因的获取,化学合成法,cDNA文库基因组DNA文库,聚合酶链式反应,1.目的基因的获取,1)化学合成法2)基因组DNA文库3)cDNA文库4)聚合酶链反应(PCR),1）化学合成法,主要用于合成编码小分子活性多肽的基因,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,较短的核酸片段（60-80bp）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针,2)从基因组DNA文库钓取目的基因,3）从cDNA文库钓取目的基因,4）PCR技术,染色体,（四）基因载体,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准,能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,1.质粒(plasmid),特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。,质粒,目录,噬菌体DNA改造系统gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,2.噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,3.粘性质粒(cosmid),4、带有真核生物基因表达组件的质粒真核生物与原核生物催化转录、翻译及其后修饰的酶和起始复合物的结构不同，医学研究需要能表达真核生物基因的表达载体。由于病毒对宿主细胞有依赖性和可整合性，真核表达组件不少上来自病毒。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。,酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达能力）3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点）4.细胞内稳定性高（持续表达和复制）5.具有供筛选用的（遗传标记）6.相对分子量小（一定的容量）,基因载体应具备特点,二、重组DNA技术基本原理,以质粒为载体的DNA克隆过程,目录,基因工程的基本步骤,1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR),目的基因及载体的分离,分,*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,目录,限制性内切核酸酶酶切,切,目的基因用BamH切割,载体用BamH切割,（三）外源基因与载体的连接,1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,目录,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,EcoR切割位点,Bgl切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目录,2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,目录,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,目录,4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,目录,DNA连接酶-磷酸二酯键的形成,目的基因与载体的连接,接,重组体,接,重组体转入受体细胞,转,转化（transformation）转染（transfection）感染（infection）,CaCl2处理,受体细胞,50-100mmol/L,CaCl2,感受态细胞,重组体转入细胞,噬菌体体外包装,（五）重组体克隆的筛选与鉴定,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA的阳性克隆。,(1)抗药性标记选择(2)标志补救(3)分子杂交法:原位杂交、Southern印迹,(1)酶联免疫检测(2)放射免疫法(3)免疫印迹法（Westernblot）,1.直接选择法,2.间接选择法,(插入失活法)抗药性标记选择,目录,互补的检测,目录,原位杂交,目录,Southern印迹,目录,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,目录,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,目录,外源基因在宿主细胞中的表达,表,原核表达体系：大肠杆菌（E.coli）,真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞,1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点,大肠杆菌表达体系的优点：积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；操作安全，致病能力低；成本相对低得多；,E.coli表达体系的不足不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)很难表达大量可溶性蛋白热源、内毒素不易除去,大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,目录,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、不经济,转染将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射,2.真核表达体系酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,表达载体pFASTBACI的物理图谱,目录,目录,小结,（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,三、重组技术与医学的关系,（二）生物制药,重组DNA医药产品,目录,基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA