疫苗工程课件

疫苗工程,复旦大学医学院免疫学系高波13号楼10楼1019,疫苗发展历史新概念疫苗疫苗学的发展方向及展望,EdwardJenner(1749-1823),LouisPastuer(1822-1895),疫苗的概念,凡具有抗原性接种于机体可产生特异的自动免疫力，可抵御感染病的发生或流行，统称为疫苗细菌菌苗病毒、立克次体疫苗毒素类毒素,疫苗的分类,1、减毒活疫苗麻疹、风疹、腮腺炎疫苗等2、细菌或病毒灭活疫苗甲肝疫苗等3、多糖疫苗细菌的多糖荚膜4、组分疫苗（亚单位疫苗）流感疫苗,5、基因工程疫苗病毒载体疫苗、基因缺失疫苗等6、合成肽疫苗实验室研究阶段7、抗独特型抗体疫苗8、核酸疫苗,第一章疫苗的历史、发展和前景,1.1疫苗防病的历史渊源,以毒攻毒天花人痘接种法牛痘苗天花的消灭,1.2微生物学的黄金时代和第一次疫苗革命,Leeuwenoek1676年显微镜Pasteur发酵、霍乱、炭疽、狂犬病Koch染色、固体培养基Calmette、Guerin卡介苗,德国细菌学家贝林（EmilAdolfvonBehring，18541917）,法国微生物学家巴斯德(LouisPasteur,1822-1893）,1.3历史上的重大疫苗事故和灾难,1.4以重组DNA技术为代表的第二次疫苗革命,化学生物化学遗传学免疫学,1986年用基因工程制备的乙型肝炎表面抗原获得成功并正式作为肝炎疫苗用于临床,1.4.2化学和蛋白质化学技术,1.4.3免疫学的贡献,1.4.1重组DNA技术,1.5疫苗对消灭和控制传染病的不朽功绩,改善卫生条件使用特异的治疗有效的疫苗接种,下呼吸道感染1(7发达国家)腹泻2麻疹4结核5疟疾6,发展中国家十大致死性疾病,1.5.1疫苗对控制传染病及降低其死亡数的巨大作用,1.5.2世界卫生组织的扩大计划免疫措施（EPI）,疫苗的冷藏和低温运输问题注射器的消毒和重复使用专业人员的训练和培养EPI计划的监控、评估和反馈,1.5.3使用疫苗消灭传染病的可能性,1.5.3.1天花的消灭1977年10月26日1979年10月26日1.5.3.2小儿麻痹症的消灭中国2000年世界2005年前,我们，全球扑灭天花证实委员会委员，证实扑灭天花已经在全世界实现。,1.5.421世纪面临的新挑战,1.5.4.1传染病仍然是导致死亡的主要病因白喉、脊髓灰质炎、百日咳、乙型肝炎、破伤风、麻疹、结核,1.5.4.2新发现的传染病,1973年轮状病毒1977年埃伯拉病毒、肺炎军团菌1981年金黄色葡萄球菌1982年O157：H7大肠杆菌1983年幽门螺杆菌、HIV1988年丙型肝炎病毒,1.5.4.3新回潮的传染病,结核病每年新发病人1000多万，死亡300万HIV感染并发、耐药性产生,1.5.4.4与传染病有关的肿瘤,肝癌乙肝病毒、丙肝病毒胃癌幽门螺杆菌子宫颈癌HPV16、18,1.6引发第三次疫苗革命的DNA疫苗,流感病毒DNA疫苗乙型肝炎DNA疫苗,艾滋病、流感、乙型肝炎、单纯疱疹病毒、疟疾、癌胚抗原DNA疫苗其中疟疾DNA疫苗进入III期临床试验,第二章疫苗和免疫,2.1免疫系统,2.1.1先天性免疫系统2.1.2获得性免疫系统,2.2免疫活性细胞,2.2.1B淋巴细胞2.2.2T淋巴细胞2.2.3抗原递呈细胞,2.3疫苗和免疫反应,2.3.1感染和免疫反应2.3.2死疫苗和体液免疫反应2.3.3减毒活疫苗和细胞免疫反应2.3.4口服疫苗和粘膜免疫反应2.3.5多糖疫苗的非胸腺依赖性反应2.3.6DNA疫苗的细胞和体液免疫反应,2.4疫苗有效免疫反应的基本要素,2.4.1疫苗的免疫原性,化学组成与结构不同的抗原能引起不同类型的免疫反应抗原的剂量也对免疫反应的形成有重要影响感染源入侵的途径也决定了人体相应的免疫反应类型疫苗的免疫原性还和佐剂的使用密切相关,2.4.2疫苗的免疫记忆性,记忆性B细胞记忆性T细胞,第三章疫苗抗原成分的纯化和研制,优质制造规范(goodmanufacturepratice,GMP)优质实验室规范(goodlaboratorypratice,GLP)优质临床试验规范(goodclinicalpratice,GCP),3.1疫苗研制的法规,3.1.1生产疫苗的厂房、车间和设备3.1.2原材料3.1.3文件制度3.1.4质量控制（QC）,3.2微生物和细胞的培养,3.2.1菌种和种子细胞的制备3.2.2细菌的发酵培养3.2.3酵母培养3.2.4细胞培养,3.3培养物固、液相分离和细胞的破碎,3.3.1离心技术3.3.2过滤3.3.3细胞的破碎,3.4疫苗抗原成分的纯化,3.4.1层析技术,离子交换层析疏水性树脂层析分子筛亲和层析聚焦层析碱性磷酸钙层析,3.4.2生物大分子提纯方案的设计3.4.3疫苗蛋白质抗原的提纯3.4.4多糖抗原的提纯3.4.5内毒素的清除,第四章疫苗佐剂的研究进展,完全福氏佐剂（CFA）：密度较小的矿物油、干的死分枝杆菌常用死结核杆菌以及乳化剂如ArlacelA组成不完全福氏佐剂（IFA）：不含分枝杆菌,4.1植物佐剂,加强细胞的吞噬作用刺激免疫细胞产生各种细胞因子刺激抗体产生皂角素成分：QuilA、QS-21,4.2细菌佐剂,4.2.1霍乱毒素（CT）和大肠杆菌不耐热毒素（LT）4.2.2重组百日咳毒素（PT）4.2.3B群流脑杆菌的外膜小体（OMV）4.2.4卡介苗（BCG）4.2.5细菌脂多糖（LPS）,4.3人工合成佐剂,4.3.1脂质体4.3.2MF59佐剂4.3.3免疫刺激复合物佐剂,4.4铝佐剂及其它无机成分佐剂,4.4.1铝佐剂（alum）十二水和硫酸铝钾部分纯化的蛋白抗原、破伤风类毒素或白喉类毒素在磷酸根和碳酸氢根存在下沉淀出的含磷酸铝的混合物,4.4.2磷酸钙佐剂抗原在0.07M的Na2HPO4H2O的溶液中透析后，快速加入0.07M的CaCl2H2O溶液，调节pH至6.87.0，形成的凝胶用生理盐水洗后，再重悬于生理盐水中,4.5细胞因子佐剂,4.5.1细胞因子调节免疫功能的机理4.5.2细胞因子的佐剂作用,4.6核酸佐剂,4.6.1CpG基序：5-X1X2CGYY-34.6.2使用能表达与免疫相关的细胞因子的核酸载体作为佐剂4.6.3双链RNA长期以来被认为是非常良好的干扰素诱生剂,4.7投递系统,减毒的细菌或病毒与抗原的重组DNA投递系统某些化学物质能在体内共存的可生物降解的聚合物（BBP），例如PLGA、PLG、脂质体、葡聚糖、淀粉等,4.8新佐剂的选择和研究方向,疫苗的成分免疫途径,第五章实验动物在疫苗研制中的应用,5.1实验动物的管理,5.1.1实验动物管理的人事5.1.2实验动物的饲养和管理5.1.3感染动物室的分级及要求,5.2实验动物模型,天然的动物模型诱导的动物模型阴性模型孤寡模型,5.3实验动物在疫苗研制中的应用,5.3.1一般毒性试验5.3.2特殊毒性试验5.3.3毒力实验5.3.4疫苗的效力实验5.3.5多克隆和单克隆抗体的制造5.3.6转基因动物的应用5.3.7基因敲除动物的应用,第六章新概念疫苗,以往疫苗成功的原因在于它能有效地诱导机体产生保护性抗体然而对胞内菌如结核杆菌、利什曼原虫及寄生虫等这些抗体几乎不起作用对HBV、HCV、HIV、疟原虫等感染需要细胞和体液免疫的双重介导,一、核酸疫苗,所谓核酸疫苗（nucleicacidvaccine），是将含编码外源蛋白基因的质粒DNA直接导入动物组织，外源基因在体细胞表达后，产物被递呈，与MHC结合，刺激机体产生体液和细胞免疫应答，又称裸DNA疫苗,接种后，蛋白抗原在宿主细胞内表达，与病原的自然感染相似，可以诱导细胞和体液免疫外源基因在体内存在较长时间，不断表达外源蛋白，持续刺激产生较强和较持久的免疫应答具有共同的理化特性，可将含不同抗原基因的质粒混合进行联合免疫质粒载体没有免疫原性，可以反复使用,二、T细胞疫苗,T细胞疫苗是指将T细胞或体外T细胞表位多肽刺激产生的T细胞作为疫苗接种，用于治疗某些自身免疫性疾病,治疗某些自身免疫性疾病,T细胞引起的迟发型变态反应可能是某些自身免疫病的病因动物实验中，把动物体内引起疾病的T细胞移入其它健康动物体内，也能引起疾病如果把致病的T细胞灭活后注入体内，即使致病T细胞再移入体内，也不再引起疾病小鼠EAE中已成功，还用于人类MS,治疗某些病毒性疾病,用多肽在体外诱导产生特异性CTL，经克隆、扩增、筛选和鉴定后，仅将MHC-I类限制的CD8T细胞输入机体，诱导细胞免疫应答产生转染了HCV基因的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞皮下注射，发现MHC-I限制的CTL表位多肽体外诱导的特异性CTL，在体内外对HCV感染细胞均具有杀伤作用,三、DC疫苗,DC是目前发现的功能最强的APC，也是唯一能激活初始T细胞的APC应用抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，然后回输或免疫接种荷瘤宿主或带病毒特异性抗原的宿主，进行免疫治疗利用DC与肿瘤细胞融合成为新型带有DC功能及肿瘤特异抗原的融合细胞瘤苗利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染DC，使之在DC内持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫,一、针对传染性疾病的新疫苗,1、核酸疫苗的发展,用感染机体组织中提取出的DNA序列，经调整后局部注射诱导保护性免疫反应,DNA免疫在动物模型中是有效的，但在人体肌注DNA却不一定能产生活跃的免疫反应只有针对乙型肝炎和疟疾的核酸疫苗在人体中诱导了保护性的免疫反应,2、治疗性疫苗的发展,HIV、HBV、螺旋杆菌、粘膜念珠菌、疱疹病毒、人乳头瘤病毒等,3、当今疫苗的进步,肺炎链球菌的多价多糖疫苗自从1977年在美国就已经通用，但在儿童中产生了一种不协调的免疫反应七价肺炎链球菌复合性多糖疫苗流感疫苗是从鸡胚中培养的注射用无活力流感病毒鼻内喷剂,二、针对非感染性疾病的新疫苗,1、癌症,小鼠胸腺肿瘤细胞传递到膜上表达的GPI-B7-1蛋白，可保护小鼠对抗此种肿瘤黑色素瘤ALVACgp100基因、结直肠癌ALVACCEA-B7.1基因、乳腺癌HER2/Neu等,2、自身免疫性疾病,类风湿性关节炎（RA）多发性硬化（MS）重症肌无力食物性过敏I型糖尿病,吸毒、吸烟动脉粥样硬化避孕,3、针对大规模杀伤性生物武器的疫苗,炭疽天花鼠疫脊髓灰质炎,三、新疫苗的传递技术,肠外给药，许多需要注射增大粘膜免疫和全身免疫,1、透皮性免疫预防,动物研究已显示在局部应用疫苗后，有全身性和粘膜性抗体产生药剂如霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定性肠毒素，与疫苗抗原联合，如破伤风类毒素，在动物皮肤应用后可起辅助作用并生成保护性抗体对于人类粘膜表面的应用，非毒性突发变异种或小单位霍乱毒素和大肠杆菌肠毒素是需要的其它一些辅助物如细菌外毒素、IL-1、IL-2、TNF-已显示局部免疫反应,2、转基因可食性植物递送疫苗,经基因改造的植物可在局部产生疫苗抗原土豆和西红柿已从诺瓦克病毒、产毒性大肠杆菌、霍乱弧菌和HBV中合成了抗原土豆中产生的重组细菌抗原、B型热不稳定型肠毒素，食用后可产