流式细胞检测完整ppt课件

王力2015-07-07，流式细胞仪，精选，2，这是什么意思？流式细胞术：一种快速测定流体流动系统中单个细胞或颗粒的物理和生物化学特征的方法。流式细胞仪(FCM)-流式细胞仪流式细胞仪-流式细胞仪，选择，3，BDFACSVantage，BDCalibur，流式细胞仪，BD流式细胞仪流式系统，Beckmann Cytoflex，MiltenyimacSquant，Guava 5HT微毛细管细胞仪，选择，4，流式细胞仪的组成，光学，电子，软件，选择，5，样品规格：96孔板或1.5毫升细管，样品制备，选择，6，工作流程，样品制备，荧光染色，样品检测数据分析，荧光检测器，直方图样本：0.2-150微米的粒子最快可以在一秒钟内测量成千上万个细胞。鞘液： 10ml/test waste:1l/HR run 100，000-100万个细胞/test，nos heath waste waste:500nm，sp 500=pepercpfitcpe更强，适用于弱表达抗原FITC是最便宜的，适用于强表达抗原的选择，常用荧光物质的应用，选择，直方图和位图，组织图)单参数分析。x轴：荧光信号强度。y轴3360单元号。点图)双参数分析。XandYaxis:两种荧光信号强度。每个点代表一个单元。LogLin:荧光强度坐标可以是线性的。它也可以是对数的、选择性的和直方图的：细胞亚群可以根据一个单一的因素来区分，70个细胞每个细胞有大约400个左右的荧光强度。选择，25，血细胞分组(红细胞溶解后)，位图：根据多种因素区分细胞亚群，选择，荧光补偿，校正光谱重叠：目前使用的荧光染料都是宽光谱的，两者之间的发射光谱范围有一定的重叠。为了克服这种误差，可以使用荧光补偿电路来建立合理的荧光信号补偿。我需要准备什么？1.为什么要进行流式细胞检测？流式细胞术是最好的检测方法吗？探测的原理是什么？要测试的物质是什么？2.哪里：荧光标记的物质在哪里？有必要固定细胞吗？出拳？3.哪个：选择哪个荧光标记？4.样品制备过程如何，有多少样品？(空白对照，阴性对照.)5。当：预约(175874947群分享下载申请表)Doit！(适当的细胞密度和避免细胞聚集)、选择、28、应用范围、绝对细胞计数和生存力分析细胞增殖细胞周期凋亡细胞毒性试验抗原定量检测线粒体膜电位检测.选择，29，实验对照设计，空白对照ALL:使用未标记细胞的平行测定来确定待测样品的基本荧光域值或染色方法是否成功。阴性对照：调整每个荧光检测器的适当放大倍数，即确定待测样品的基本荧光域值。普通同种型对照(与一级抗体相同种源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白)用于消除抗体和细胞之间非特异性结合的背景。阳性对照：用已知表达某些抗原的细胞(阳性细胞)进行平行实验，通常用于检测抗体是否正常或确定实验方法的稳定性和准确性。补偿控制：在多色分析中，用于多色标记的各种荧光抗体分别与样品进行单色标记，以确定待调整的荧光信号的光谱重叠。单色分析：建立同型抗体控制多色分析：同型控制，补偿控制，选择，30，细胞周期：一个细胞周期从完成一个分裂到完成下一个分裂。(细胞中的DNA含量随着细胞周期过程而周期性变化。)脱氧核糖核酸含量：G1(脱氧核糖核酸合成前，2C)，间期S(脱氧核糖核酸合成，2C-4C)，G2(脱氧核糖核酸合成后，4C)间期米(脱氧核糖核酸，4C)。利用核酸标记法，通过流式细胞仪测定细胞中的相对DNA含量，并可分析细胞周期各阶段的百分比。然而，在分裂阶段(M阶段)的早期、中期、晚期和晚期阶段，正常流量不能用于定量检测。1.DNA细胞周期分析，应用实例，选择，31，DNA细胞周期分析，选择，32，实验步骤和注意事项：1。细胞周期固定：将200微升细胞(单层培养的细胞需要先用胰酶消化)加入1.5毫升离心管中以300克的速度离心5分钟。用1PBS洗涤一次离心去除上清液加入300微升溶解沉淀细胞缓慢加入700微升在-20预冷却的100%乙醇固定细胞(在固定化过程中应边摇边滴加乙醇，不会发生细胞凝聚，否则会严重影响实验结果)最后，乙醇的最终浓度为70% 在-20孵育至少3小时(建议在4孵育过夜，效果会更好)。2.以300克的速度离心固定细胞5分钟，并用1PB清洗一次。将细胞用200微升番石榴细胞周期试剂重悬，在室温下孵育30分钟，并避光。3.用200目细胞筛过滤细胞(如果使用PI染色，必须过滤细胞)。显微镜下未发现细胞团块，用番石榴流式细胞仪检测细胞。1。细胞周期分析，选择，33，2。早期凋亡检测，选择，34，2。早期凋亡检测结果，正常细胞：Annexinv(-)7-AAD(-)早期凋亡细胞：AnnexinV()/7-AAD(-)晚期凋亡细胞：AnnexinV()/7-AAD()，CD95/FASL刺激诱导凋亡，选择，35，实验步骤，1。样品制备(贴壁细胞):弃去培养细胞中的旧培养液(对数生长期)，加入胰酶消化细胞。收集旧培养基，离心获得凋亡或死亡细胞，与消化细胞混合，然后检测。2.细胞染色：加入100ulGuavaNexin(项目编号。4500-0450)和100微升制备的细胞悬液加入到96孔微孔板的相应孔中，并在室温下避光孵育20分钟；尽快(1小时内)通过流式细胞术获得结果。流式细胞术用于检测和获取数据。注：实验应优选包括实验组、阴性对照组和阳性对照组(凋亡诱导组)。凋亡的早期检测结果，选择，36，凋亡，凋亡是一个动态事件，在不同时期表现出不同的凋亡信号。早期磷脂酰丝氨酸(PS)暴露在细胞膜上，AnnexinV结合PS成为检测早期凋亡最常用的指标。此外，线粒体膜电位的变化和细胞色素C的释放也被认为是细胞凋亡的早期信号。中期caspase家族的蛋白分布于各种凋亡途径，是中期凋亡的标志。FLICA底物可用于检测活化的半胱天冬酶蛋白。晚期DNA片段化是晚期凋亡的一个显著特征。用原位末端标记法标记断裂的DNA片段。凋亡途径、选择、半胱天冬酶-8外源性肿瘤坏死因子-/脂肪酸受体反应环境、半胱天冬酶-9内源性细胞色素c释放损伤或细胞周期停滞、半胱天冬酶-3/7关键执行蛋白、半胱天冬酶-1、3、4、5、6、7、89的检测、半胱天冬酶家族蛋白酶是细胞程序性死亡过程的中心点。38、GuavaIncyteIC50/EC50自动分析，IC50是半抑制浓度，指药物