实时荧光定量PCR技术原理

实时实时实时实时荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCR技术原理技术原理技术原理技术原理 王秋泉王秋泉王秋泉王秋泉 Field Application Scientist Tel: 800 820 8982 / 400 820 8982 什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量PCR?PCR? 一种实时监控核酸扩增的技术 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。 2Life Technologies 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作? ? PCR反应液加入了 各种类型的荧光标记物 3 一个PCR循环 Life Technologies 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作? ? 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强 4 PCRPCR 大量大量大量大量PCR产产产产物物物物 PCR 产物 Life Technologies 无论是哪个型号,所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作? ? 2. 光源 5 1. 热循环模块 3. 检测器 Life Technologies 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作? ? 每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加 6 循循循循环环环环1 滤滤滤滤光片光片光片光片 A 样样样样品品品品 1 Level: Life Technologies 最后,定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作? ? 7Life Technologies 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理 8 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理 Life Technologies 两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法 染料法染料法染料法染料法染料法染料法染料法染料法TaqManTaqMan探针法探针法探针法探针法探针法探针法探针法探针法 9Life Technologies TaqMan水解探针：5 端 荧光报告基团 与靶基因特异性结合的序列 3 端 荧光淬灭基团 TaqManTaqMan探针法探针法探针法探针法探针法探针法探针法探针法 10 报告基团报告基团报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团 Life Technologies 完整的探针： 检测不到报告荧光 TaqManTaqMan水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理 切断的探针： 检测到报告荧光 11 能量 激发光激发光 荧光共振能量转移，FRET Life Technologies 变变性性 (95(95C)C) 12 Life Technologies 退火退火 (60(60C)C) 13 Life Technologies 14 Life Technologies 15 Life Technologies 16 Life Technologies 17 Life Technologies 18 Life Technologies ? 19 Life Technologies Taq is special . . . ?5-3外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性 20 ?水解探针水解探针水解探针水解探针，使报告基团和淬使报告基团和淬使报告基团和淬使报告基团和淬 灭基团分离灭基团分离灭基团分离灭基团分离 Life Technologies 21 Life Technologies 22 Life Technologies 23 Life Technologies 24 Life Technologies 25 Life Technologies 26 Life Technologies 27 Life Technologies 28 Life Technologies 29 Life Technologies 30 Life Technologies 31 Life Technologies 32 Life Technologies 33 Life Technologies 34 Life Technologies 35 Life Technologies 36 Life Technologies 37 Life Technologies 38 Life Technologies 39 Life Technologies Burp! 40 Life Technologies 实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化 荧光 41 荧光 循环数 Life Technologies 报告荧光: 6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、Texas Red、CY5 淬灭荧光: MGB-NFQ、TAMRA、BHQ 参比荧光: ROX 荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合 42 常用的荧光组合： FAM目的基因1 VIC目的基因2/内对照 NED目的基因3 ROX参比荧光 Life Technologies 荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合 7300实时荧光定量PCR系统 ChannelDye ExamplesExcitation Wave LenthghEmission Wave Lenthgh 1FAM, SYBR 455485nm 520nm 2VIC, JOE550nm 3NED，TAMRA580nm 4ROX620nm 43 7500实时荧光定量PCR系统 Channel Dye Examples Excitation Wave LenthghEmission Wave Lenthgh 1FAM, SYBR455485nm520 2VIC, JOE510530nm550 3NED, Cy3，TAMRA540550nm580 4ROX, Texas Red 570590nm610 5CY5 Dye630650nm650 Life Technologies 荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合 StepOne实时荧光定量PCR系统 ChannelDye ExamplesExcitation Wave LenthghEmission Wave Lenthgh 1FAM, SYBR 455485nm520 2VIC, JOE510530nm550 3ROX 570590nm620 44 StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 ChannelDye ExamplesExcitation Wave LenthghEmission Wave Lenthgh 1FAM, SYBR455485nm520 2VIC, JOE510530nm550 3NED，TAMRA540550nm580 4ROX, Texas Red 570590nm620 Life Technologies 荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合 7900HT实时荧光定量PCR系统 ChannelDye ExamplesExcitation Wave LenthghEmission Wave Lenthgh 1FAM , SYBR Green 488nm 520 nm 2TET 540nm 3JOE , VIC 550nm 4NED 570nm 5TAMRA 580 nm 6ROX 610nm 45 ViiA 7实时荧光定量PCR系统 ChannelDye ExamplesExcitation Wave LenthghEmission Wave Lenthgh 1 FAM, SYBR, SYTO9 (MeltDoctor), Fluorescein, SYPRO Orange 455485nm520nm 2VIC, JOE, TET, HEX 510530nm550nm 3NED, BODIPY TMR-X，TAMRA540550nm580nm 4ROX, Texas Red 570590nm620nm 5LIZ630650nm680nm 6Alexa Fluor, Joda-4650670nm710nm Life Technologies SYBRSYBR Green I Green I 染料染料染料染料染料染料染料染料 46 Life Technologies SYBRSYBR Green I Green I作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理 47 Life Technologies SYBRSYBR Green I Green I作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理 48 Life Technologies SYBRSYBR Green I Green I作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理 49 Life Technologies 实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化 50 Life Technologies 荧光 循环数 任何双链任何双链任何双链任何双链，非特异结合非特异结合非特异结合非特异结合 SYBRSYBR Green I Green I 方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性 51 不准确结果不准确结果不准确结果不准确结果 非特异产物信号非特异产物信号非特异产物信号非特异产物信号 Life Technologies 通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性 Tm值： DNA的双螺旋结构打开一半时的温度。 52 荧光 温度 Life Technologies 单一单一单一单一单一单一单一单一PCRPCR产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线 53 Life Technologies 荧光 温度 多个多个多个多个多个多个多个多个PCRPCR产产产产产产产产物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解曲线曲线曲线曲线曲线曲线曲线曲线 54 Life Technologies 非特异扩增引物二聚体 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理 55 定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理 Life Technologies 线性增长期 平台期 PCRPCR动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段 56 指数增长期 对数图谱线性图谱 基线期 Life Technologies 可变的平台期 96 次重复次重复次重复次重复 指数增长期内扩增曲线具有高度重复性指数增长期内扩增曲线具有高度重复性指数增长期内扩增曲线具有高度重复性指数增长期内扩增曲线具有高度重复性指数增长期内扩增曲线具有高度重复性指数增长期内扩增曲线具有高度重复性指数增长期内扩增曲线具有高度重复性指数增长期内扩增曲线具有高度重复性 57 循环数循环数循环数循环数 指数增长期内重复性好 荧光信号荧光信号荧光信号荧光信号 Life Tech