葡聚糖凝胶柱层析.ppt

实验1-1核苷酸的醋酸纤维膜电泳分离鉴定,带电荷物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。各种核苷酸在pH3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中电离差异，带有不同的净电荷，在电场中的迁移率不一样，从而达到分离的目的。,一、原理：,1、水平电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪、电吹风、醋酸纤维膜。2、0.02mol/L柠檬酸缓冲液(pH3.5)：取柠檬酸(C6H807.H20)16.2g，柠檬酸三钠(Na3C6H507.2H20)6.7g。用蒸溜水溶解，定容到2000ml。3、腺苷酸溶液：AMP、ADP、ATP，用水配成50mg/ml。,二、仪器与试剂：,三、实验步骤：,1、准备好电泳槽，向二边槽内加入柠檬酸缓冲液(pH3.5)，使两边等高。2、醋酸纤维素薄膜裁成28cm，先在蒸馏水润湿，然后凉干。在粗糙面距一端1.5cm画一条线，标出点样点。3、点样：用毛细管在点样点处点样2-3次，注意斑点直径23mm。4、在电泳槽的阳极和阴极放入滤纸，使其下端浸入电泳缓冲液中。5、粗糙面朝上，将醋酸纤维膜平稳地放在电泳槽的滤纸架上，注意二点：点样点在负极。滤纸桥与醋酸纤维膜贴紧。,6、盖上电泳槽的盖子，平衡10分钟.7、接上电极，点样端在负极，接通电源，调整电压在100V，室温通电40分钟。8、电泳完毕后，关闭电源，取出滤纸，电吹风吹干。9、在紫外灯下观察，可见核苷酸的深蓝色斑点。,画出核苷酸在醋酸纤维膜上的位置，并分析其分离依据。,四、结果与讨论：,实验1-2SephadexG-50分离生物大分子,1、凝胶层析法的原理：,凝胶层析是一种液相层析，其原理是分子筛效应。根据不同分子的分配系数不同而分离。当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。这样，就可使大小不同的分子分开。,总体积：Vt(totalvolume)，外水体积：Vo(outervolume)内水体积：Vi(innervolume)洗脱体积：Ve(elutionvolume)干胶体积：Vg(gelvolume)Vt（床体积）=Vo+Vi+Vg,Ve（洗脱体积=Vo+KdVi。,层析的几个主要参数：,Kd值的计算与意义：,Kd=(Ve-Vo)/ViKd=0,则Ve=Vo，全排阻；Kd=1,则Ve=Vo+Vi，全掺入；0Kd1，则VeVo+Vi，Sephadex对它们有吸附作用，如芳香族AA。,2、影响凝胶层析分离的因素：,2.1、样品的体积、粘度。2.2、层析柱：（高度，内径，材质）。2.3、洗脱液的流速：过慢：扩散；过快：拖尾。2.4、洗脱液的离子强度、pH。,2.1、样品的体积、粘度：,分析分离时：Vsample=1-4%Vbed；制备分离时：Vsample=25-30%Vbed.分离体积(Vsep):相邻两组分Ve之差，用于衡量相邻两组分的分离效果。Vsep=Ve1-Ve2，当VsampleVsep时，则相邻两组分可完全分离。相对粘度：样品液粘度与洗脱液粘度的比值。分离效果只与相对粘度有关，一般来说，相对粘度不得超过1.52。今天的上样量（0.5ml）约为1%柱床体积。,2.2、层析柱：,柱长：组别分离时，530厘米；分级分离时，可长至100厘米；柱径：分析分离时，由于样品量少，常使用1厘米直径的层析柱，若制备分离时样品量大，最好使用直径23厘米的层析柱。今天选用的是2cm50cm的层析柱。,2.3、洗脱液的离子强度和pH值：,多糖类：水是最佳洗脱剂。蛋白类：离子强度0.02M的盐溶液作洗脱剂，以消除凝胶的吸附作用。pH7时，酸性物质易被洗脱。pH7时，碱性物质易被洗脱。,3、凝胶层析法的应用：,1、分子量的测定:利用已知分子量的标准蛋白洗脱，制备洗脱标准曲线。2、多组分混合物的分离:利用Kd的差异分离。3、脱盐与分离纯化:用于脱盐的凝胶多为颗粒大、交联度高的凝胶。此时，溶液中大分子（如蛋白质）的kd=0，盐类的kd=1，易于分离脱盐。,4、凝胶的特性、种类、使用与保存：,凝胶是一种具有立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等),吸收大量液体（水或洗脱液）溶胀而成。,4.1、凝胶的特性：,1、惰性：保证其不与待分离物质发生化学反应。2、稳定。3、低电荷：避免离子交换效应的发生。4、足够的机械强度：在一定的操作压下不形变。,4.2、凝胶的几种主要类型：,1、天然凝胶：马铃薯淀粉凝胶、琼脂及琼脂糖凝胶。2、人工合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶。,葡聚糖凝胶的型号：,目前，凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶，商品名称：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通过1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三维空间网状结构。,4.3、Sephadex的使用原则：,1、型号选择：组别分离：SephadexG25最为常用。例如样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐；分级分离：多种蛋白质分离时，根据待分离物中各组分的分子量大小和分布范围来确定型号。同时，参考商家产品信息。2、粒度的选择：组别分离时，选用较粗的颗粒。分级分离时，以细颗粒凝胶为主，而且要求颗粒大小均匀。同型号的胶，同样的床体积，粒度小的胶对样品的分离度要优于粒度大的胶，即有较高的分辨率。,4.4、凝胶的防腐、保存：,Sephadex、Sepharose是多糖类物质，易于长菌。因此，常在凝胶不用时，加入抑菌剂，使用时再除去。1.常用0.02叠氮钠作防腐剂。2.常用20乙醇溶液保存各类凝胶。,5仪器、材料：,1、仪器与材料：柱层析装置、SephadexG-50。2、样品混合物：蓝色葡聚糖-200(MW=2000kDa,蓝色)、细胞色素C(MW=12.4kDa，红色)和重铬酸钾(K2Cr2O7,MW=294.18，黄色)的混合物。3、洗脱液：蒸馏水。,6、实验步骤：,6.1、凝胶用量的计算。6.2、凝胶的溶胀。6.3、装柱与平衡。6.4、上样。6.5、洗脱和收集。6.6、绘制洗脱曲线。6.7、凝胶的回收与保存。,6.1、凝胶用量的计算：,根据层析柱的容积和所选凝胶溶胀后的柱床体积计算出所需凝胶干粉的重量。凝胶的克数VbedVc。,6.2、凝胶的溶胀：,称取3克SephadexG-50凝胶干粉投入烧杯中，加60mL蒸馏水，在沸水中溶胀2小时。沸水浴溶胀的好处：省时，还可消毒，驱除凝胶颗粒内部的气泡。,6.3、装柱与平衡：,将洗净的层析柱垂直固定在支架上。柱内装满蒸馏水，排除层析柱连接系统内的空气，关闭出口。打开柱底部的夹子，调节流速，以0.5mL/min流速慢慢流下，柱内留下约2/3柱体积的蒸馏水。然后，一边用玻棒搅拌，一边用滴管缓慢地加入SephadexG-50浆液，使凝胶均匀沉降。连续地灌注凝胶浆液，直到凝胶沉降到距上端5cm为止。胶床上部保持2-3cm水层，关闭下部出口。室温静置2h，以平衡凝胶。,注意点：防止胶床出现气泡、断层。,6.4、上样：,上样前：1.柱子要用洗脱液洗脱平衡。2.除去胶面之上的液体：用吸管吸，或打开层析柱下的止水夹，使凝胶表面上的蒸馏水刚好流入胶面，迅速关闭止水夹，以防空气进入凝胶。,上样：用自动进样器吸取0.5ml混合样品，小心地加到柱床表面（切勿冲动胶面），保持胶面平整.使样品液成一薄层。2.随即打开层析柱下面的出口，使样品完全进入胶柱内。3.用滴管小心地加少许蒸馏水到凝胶的上表面。使胶面上保持2-3cm厚的水层。4.同时，接通洗脱液，用刻度试管，分别收集洗脱液。,6.5、洗脱和收集：,调节洗脱液流速为0.5ml/min,仔细观察柱内样品分离现蒙，用刻度试管收集并置取洗脱液的体积。等兰色到柱的烧结板时再另换一个刻度试管收集，用刻度试管收集并量取洗脱液的体积。,注意观察样品的分离现象。最后，根据记录的实验结果，计算层析柱的Vo、Vi以及样品的Ve、Kd。,6.6、绘制洗脱曲线：,在座标纸上以洗脱体积为横座标，以洗脱液颜色深度为纵座