1DNA重组技术的基本工具.ppt

生物选修3现代生物科技专题,目录,专题1基因工程专题2细胞工程专题3胚胎工程专题4生物技术的安全性和伦理问题专题5生态工程,专题1基因工程,是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,一、基因工程的概念,由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，产生人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,二、基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译,技术发明使基因工程的实施成为可能1.基因转移载体的发现2.工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现5.重组DNA表达实验的成功6.第一例转基因动物问世7.PCR技术的发明,基础理论和技术的发展催生了基因工程,专题1基因工程,1.1DNA重组技术的基本工具,转基因抗虫棉,抗虫棉,普通棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接导入,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,准确切割DNA的工具“分子手术刀”DNA片段的连接工具“分子缝合针”基因转移工具“分子运输车”,基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：,DNA重组技术的基本工具,思考：,在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？现今存在的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一种稳定状态？怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？,原核生物很容易受到自然界中外源DNA的入侵，但是长期的进化过程中，这些原核生物却没有因为外源DNA的入侵而灭绝。根据我们刚刚掌握的知识，你能推测这其中的原因吗？,原核生物细胞中的限制酶会将外源DNA切割掉，使之失效，以保证自身的安全，但是不会切割自身的DNA，这是原核生物在长期进化过程中形成的一套防御机制。,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1、来源：,主要从原核生物中分离纯化出来,2、种类：约4000种,3、作用:,限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR）能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。,黏性末端,平末端,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，Sma识别CCCGGG序列:,切割DNA分子时产生的两种不同末端,限制酶切割DNA后形成的末端黏性末端、平末端是如何形成的？,思考：,什么叫黏性末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,切割位点,和之间,和之间,未端类型,平末端,黏性末端,4、切割后的形式：2种末端,注：限制酶是一大类酶，不是一种酶。限制酶大多可以专一性识别双链DNA分子上的某种特定核苷酸序列，限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称，重复排列的。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？（被同一种限制酶切断的几个来源不同的DNA是否具有相同的黏性末端？）,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考与探究,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,T,磷酸二酯键,A,磷酸二酯键即脱氧核糖、磷酸之间的连接,演示,重播,DNA连接酶“分子缝合针”,切断的DNA片段要与受体细胞的DNA连接，你觉得可以用什么酶？,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？,二、DNA连接酶“分子缝合针”,1、作用：,将双链的DNA片段连接起来（连接两核苷酸之间的磷酸二酯键）,DNA聚合酶,DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点,DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。,DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。,此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,DNA连接酶和DNA聚合酶的异同,基因工程中所用的连接酶有两种：从大肠杆菌中分离得到的Ecoli连接酶、从T4噬菌体中分离得到的T4连接酶。这两种酶的催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。连接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二酯键。DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成子链；而连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此连接酶不需要模板。两者都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,都形成磷酸二酯键本质都是蛋白质,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？,EcoliDNA连接酶：连接黏性末端,T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端,2、种类：,EcoliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接T4DNA连接酶既可“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,例、阅读课本P5，图14，回答下列问题：EcoRI是一种酶，其识别序列是，切割位点是与之间的键。切割结果产生的DNA片段末端形式为。不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是连接酶，此酶的作用是在与之间形成键而起“缝合”作用的。还有一种连接平末端的连接酶是。,限制,GAATTC,G,A,磷酸二酯,黏性末端,DNA,DNA片段,磷酸二酯,T4DNA连接酶,DNA连接酶“分子缝合针”,DNA分子的切割和连接,二个不同的DNA的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端。,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入细胞的工具就是载体。,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,1.使用载体的目的：作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中；利用它在宿主细胞内进行大量的复制。,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？,思考：,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？,思考：,导入受体细胞的目的基因不能复制，将在细胞增殖中丢失。,作为载体没有切割位点将怎样？,载体没有切割位点，外源的目的基因不可能插入。,目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？,如果载体上有遗传标记基因，这样，在载体进入受体细胞后，就可通过标记基因的表达来检测。,如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？,载体对受体细胞有害，将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的目的基因也无立足之地。载体不能分离，就不能获得更多带有目的基因的载体。,2.作用：将外源基因导入受体细胞,3.载体的条件：,能自我复制有一个或多个限制酶的切割位点有遗传标记基因对受体细胞无害、易分离载体DNA分子大小应适合，以便提取和体外操作,作为载体的必要条件,能自我复制有切割位点能与目的基因结合能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达；有遗传标记基因对受体细胞无害比较容易得到,1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必须具备自我复制能力，或整合到受体染色体DNA上，随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必须有标记基因，以便重组后进行筛选。4）载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和体外操作。,4.载体的种类：,质粒（最常用）噬菌体的衍生物某些动植物病毒,质粒,拟核,大肠杆菌细胞,基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,大肠杆菌及质粒载体结构模式图,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,目的基因的检测和表达,处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,模拟操作：重组DNA分子的模拟操作,注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对；第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。,练习：,1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）A.同种限制酶B.两种限制酶C.同种连接酶D.两种连接酶,A,2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（）A.能复制B.有多个限制酶切点C.具有标记基因D.它是环状DNA,D,3、关于限制酶的说法中，正确的是（）A限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列BEcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,C,4、下列关于限制酶的说法正确的是（）A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键,B,5、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：GCAATTCCGGGCCTTAACGG其中和是由一种限制酶切割形成的末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是。和是由另一种限制酶切割形成的末端，两者要形成重组DNA片段，