反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定 优选内容

青岛农业大学毕 业 论 文 题 目：反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定姓 名： 学 院： 动物科技学院 专 业： 动物医学 班 级： 1001 学 号： 20105254 指导教师： 温建新 2014年6月5日反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定 动物医学专业 袁如意 指导教师 温建新摘要：从健康荷斯坦成年奶牛新鲜粪便中分离纯化出1 株疑似芽孢杆菌属菌株，编号为K。对该菌株进行形态学观察、生化试验、药敏试验及安全性试验等。试验结果表明，该菌菌体革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色，呈长杆状，芽孢中生，椭圆；能发酵糖醇，吲哚试验阳性，触媒试验阳性，能产生淀粉酶，并且可以液化明胶，生化试验结果表明K菌为枯草芽孢杆菌；该菌对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等抗生素表现敏感；动物安全试验表明，灌服浓度为1011cfu/mL菌液的小鼠精神状态良好，无死亡现象。本试验为获得反刍动物的有益菌种及研制反刍动物微生态制剂奠定基础。关键词：反刍动物；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定 Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains from RuminantsStudent majoring in veterinary medicine Yuan Ruyi Tutor Wen Jianxin Abstract： One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain was positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacteria strongly resisted to streptomycin, penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus subtilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations.Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification 引言枯草芽孢杆菌是存在于动物肠道中的非致病需氧菌1，可降低肠道内氧浓度，产生的枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等活性物质能显著降低肠道内大肠杆菌、沙门氏菌的数量，减少机体内致病菌2，改善了乳酸杆菌等厌氧菌的生长环境，增加有益菌，以此来保持肠道菌群的平衡，提高动物机体抗病能力。同时枯草芽孢杆菌具有耐受高温、耐酸、耐挤压等特点，在饲料加工和储存过程中不易失活3-5。枯草芽孢杆菌菌体自身合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，可将淀粉转化为单糖，能提高动物对饲料中营养的消化和吸收率；其还能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、促生长因子等，参加机体新陈代谢，利于动物机体吸收，使动物保持健康状态；还具有降解碳水化合物的酶如纤维素酶、葡聚糖酶6-7。枯草芽孢杆菌在养殖业中发挥了巨大作用，并且已经得到广泛的应用。针对鸡、猪、水产等已有大量报道，丁祥力等利用枯草芽孢杆菌WH-5净化水产养殖厂的水10，魏姗姗等从健康仔猪空肠黏膜分离到23 株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有拮抗作用的芽孢杆菌11，虽然枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物中还没有广泛应用，但近年来，枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物养殖中的研究越来越多。本试验从健康奶牛粪便中分离鉴定枯草芽孢杆菌，以期为进一步深入研究枯草芽孢杆菌提供参考，并为枯草芽孢杆菌作为反刍动物微生态制剂的研制和应用提供依据。1 材料与方法1.1 样品来源 新鲜的荷斯坦成年牛牛粪便，取自青岛某奶牛养殖场。1.2 主要试剂MYP、LB培养基、西蒙氏柠檬酸盐琼脂、细菌微量生化鉴定管、三糖铁琼脂、革兰氏染色试剂盒均购自北京陆桥技术有限责任公司。细菌微量生化反应管、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。0.5%沙黄、5%孔雀绿溶液自配。1.3 仪器和设备SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司LED-2）、电热恒温培养箱（山东龙口市先科仪器公司YY0027-90）、XSP-2C生物显微镜。1.4 方法1.4.1 菌株的分离纯化取菌液接种于MYP培养基平板上，置于37恒温培养箱培养18 h；挑取疑似枯草芽孢杆菌菌落进行纯化培养，将分离纯化后得到的菌株命名为“菌K”。1.4.2 染色镜检染色采用革兰氏染色法，见文献 13。 芽孢染色采用孔雀绿沙黄染色法，见文献 13。1.4.3 生化试验按照常规试验方法对菌K进行糖苷醇发酵试验、甲基红（MR）试验、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）、淀粉水解试验、吲哚试验、产类淀粉化合物测定试验、柠檬酸盐试验、TSI试验、过氧化氢酶（触酶）试验、KOH试验、脲酶试验、明胶液化等试验。1.4.4 16S rDNA的PCR扩增和序列分析将菌K接种于5 mL LB肉汤中摇菌10 h，取4mL菌液10000r/min离心2min，参考精编分子生物学实验指南的方法提取DNA。在参考了国内外相关文献后19，由华大生物工程有限公司合成了一对芽孢杆菌属特异性引物： Primer 1：5-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3， Primer 2：5-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA-3，预期扩增片段长度为1436 bp。PCR反应体系：总体系25L ，DNA模板2L，上下游引物各加1L，10 buffer 2.5L，dNTP2.5L，Taq酶0.5L，ddH2O15.5L。PCR反应条件为：94预变性2min，95变性45s，58退火50s，72延伸1min， 72，10min，共32个循环， 4保存。PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序结果采用BLAST软件和GenBank数据库中的国内外相关芽孢杆菌16S rDNA 的序列对比，用Clustal X Method 进行同源性比较。1.4.5药敏试验按照扩散法在MYP培养基上进行药敏试验，见文献 13 。1.4.6安全性试验选取体重为3040 g的小白鼠10只，每组5只。取菌液浓度约为1011cfu/mL的LB肉汤，对空腹8 h的试验小鼠每天一次经口灌胃0.3 mL，同时设空白营养肉汤对照组。每天观察和记录，14 d后结束试验，剖检观察内脏及组织器官变化。2 结果2.1 形态学观察观察MYP培养基，为干燥型菌落，灰白色，无光泽，表面粗糙。革兰氏染色阳性，菌体呈长杆状，芽孢中生，椭圆形，染色为绿色，菌体呈红色。芽孢 图2-2革兰氏染色（1000）。图2-3 菌K芽孢染色（100）。图2-1 菌K菌落形态（1000）。2.2 生化试验结果菌K的生化试验结果见表2-1。表2-1菌K生化试验结果菌K菌K菌K葡萄糖+山梨醇+明胶液化试验+蔗糖+MR试验+触媒试验+乳糖+VP试验-KOH试验-甘醇+淀粉水解+脲酶试验+麦芽糖+产类淀粉化合物测定+TSI试验A/A+；-蜜二糖-吲哚试验+木糖+柠檬酸盐试验-注：“+”表示阳性，“”表示阴性；TSI（三糖铁培养基）上反应情况：斜面/底面，A：产酸（黄色）；K：产碱（红色）；+：阳性；-：阴性。 产气；H2S 根据伯杰细菌鉴定手册14和常见细菌鉴定手册15，上述结果均属于芽孢杆菌属的生化特性，证明分离菌为芽孢杆菌属。212112 图2-4甘醇、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵试验阳性，蜜二糖发酵试验阴性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照图2-5 山梨醇发酵试验阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照图2-6木糖发酵试验为阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照2121 图 2-8 枯草芽孢杆菌VP试验为阴性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照图2-7 接种菌K的培养基呈红色，MR试验为阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照碘液消失滴加碘液 图2-10 5min后，革兰氏碘液消失，菌K淀粉水解试验为阳性。图2-9在淀粉培养基培养的菌K菌落处滴加革兰氏碘液。1221 图2-12 接种菌K的培养液滴加碘液后为淡蓝色，产类淀粉化合物测定试验阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照图2-11接种菌K的试管戊醇层呈玫瑰红色，吲哚试验为阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照2121空白对照 图2-14 接种菌K的三糖铁培养基斜面和底面均为黄色，并且产气。1. 接种菌K 2.未接菌K对照图2-13 接种菌K的西蒙氏培养基仍为草绿色，柠檬酸盐试验为阴性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照21 图2-16 KOH试验阴性。无拉丝现象，图2-15 菌K使过氧化氢分解产生气泡，触媒试验阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照21213 图2-18 接种菌K的明胶20时为液体，明胶液化试验为阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照图2-17 接种菌K的尿素酶发酵管呈浅粉红色，脲酶试验阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K对照 3.阳性对照2.3 PCR鉴定结果对菌K进行16S rDNA的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500bp左右有特异性条带（如图2-29）。 M 1 22000bp1000bp750bp500bp250bp100bp 图 2-29 菌K的PCR扩增结果 注：M：DL Marker 2000；1：阳性对照；2：菌K将分离的菌株K的PCR产物送北京华大生物公司测序，测序结果与其他从GenBank下载的芽孢杆菌属的相关序列进行同源性比较。结果显示菌株K的核酸序列与Bacillus subtilis strain CICC 10023 (GU980947.1)的同源性最高，达到了99.9 %，因此该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。2.4 药敏试验结果对菌K进行了药敏试验，得到菌株对多种抗生素的药敏结果，如图2-19，图2-20，图2-21，图2-22，图2-23，图2-24，图2-25，并判断菌K的耐药性，如表2-2。 图2-20 7、80对菌K有抑制作用，6、9、10对菌K无抑制作用。图2-19 1、2、3、4、5、7对菌K有抑制作用，6对菌K无抑制作用。 图2-21 11、12、13、14、15、16、17对菌K均有抑制作用。图2-22 18、19、20、21、23、对菌K均有抑制作用。 图2-23 、对菌K有抑制作用，、对菌K无抑制作用。图2-24 、对菌K有抑制作用，对菌K无抑制作用。图2-25 、对菌K均有抑制作用。注：在“图2-19，图2-20，图2-21，图2-22，图2-23，图2-24，图2-25”中，1乳酸环丙沙星，2盐酸环丙沙星 ，3甲磺酸培氟沙星 ，4硫氰酸红霉素，5乙酰甲喹，6甲硝唑，7氟苯尼考， 8盐酸多西环素，9盐酸林可，10克林霉素，11延胡索酸泰妙菌素，12粘菌素，13头孢他啶，14头孢克肟，15头孢噻肟钠，16头孢曲松钠，17硫酸阿米卡星，18硫酸链霉素，19单硫卡，20安普霉素，21庆大霉素，23硫酸TMP，克拉霉素，链霉素，洁霉素，氟苯尼考，青霉素，万古霉素，新霉素，丁胺卡那霉素，复方新诺明，杆菌肽，强力霉素，庆大霉素，红霉素，多粘菌素B，阿奇霉素，诺氟沙星，麦迪霉素，四环素，先锋霉素。表2-2 枯草芽孢杆菌的药敏试验结果抗菌药物名称纸片含药量（ug/片）抑菌圈直径判断标准（mm）枯草芽孢杆菌试验结果RIS乳酸环丙沙星51516-202127mmS盐酸环丙沙星51516-202126mmS氟苯尼考301213-171822mmS克林霉素21415-20217.8mmR多粘菌素30089-111219mmS头孢噻肟钠301415-222327mmS头孢曲松钠301314-202130mmS硫酸阿米卡星301415-161719.8mmS庆大霉素101213-141521mmS克拉霉素151314-22238.9mmR链霉素101112-14150R青霉素10IU28290R万古霉素30151619.5mmS新霉素301314-171819mmS丁胺卡那霉素101112-131423mmS复方新诺明3.752425-31327.2mmR杆菌肽1089-121316mmS红霉素151314-222314mmI多粘菌素B30089-111218.2mmS阿奇霉素301314-171818mmS诺氟沙星101213-16170R四环素301415-18190R先锋霉素301415-171817.2mmI注：R耐药、I中敏、S敏感由表看出，枯草芽孢杆菌对克林霉素、克拉霉素、链霉素、青霉素、复方新诺明、诺氟沙星、四环素等有一定的耐药性，其中对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性较强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等几种抗生素表现敏感。2.5 安全性试验结果经14 d的灌服观察，小鼠生长状况良好，无死亡现象将小鼠剖检后内脏组织器官无异常变化（如图2-26，2-27，2-28），说明枯草芽孢杆菌对小鼠无毒性。 图2-27灌服菌液的小鼠剖检后腹腔内脏器胃、肠、肝、肾、脾无异常变化。图2-26 灌服菌液的小鼠剖检后胸腔内脏器心脏、肺无异常变化。 图2-28 灌服LB肉汤的小鼠内脏器官对照。3 讨论 3.1 生物学特性分析本试验通过对疑似芽孢杆菌的菌落进行形态观察、革兰染色、芽孢染色和生化试验等传统鉴定，证明该菌属于芽孢杆菌属。通过分离的菌株K进行16S rDNA的PCR扩增，得到特异性条带，测序结果和同源性分析表明，该菌鉴定结果为枯草芽孢杆菌。证明我们从奶牛粪便中分离到的菌K为枯草芽孢杆菌，此前，张红英等16从人工饲养的健康三黄肉鸡的盲肠和大肠中分离出的枯草芽孢杆菌。目前，牛用微生态制剂鱼龙混杂，动物专属性不强，常常将人、猪、禽的菌种用于牛，结果效果不明显，我们从反刍动物的新鲜粪便分离到一株枯草芽孢杆菌为开辟反刍动物专用产品做一尝试。3.2 耐药性分析为了进一步为研制牛专用微生态制剂奠定基础，我们分别对此菌的药敏特性进行试验研究。通过对枯草芽孢杆菌40种抗生素的药敏耐药性试验，发现此菌药敏谱和耐药谱清楚，可以看出枯草芽孢杆菌对常用抗生素敏感，如环丙沙星、氟苯尼考、红霉素、阿奇霉素等。这提示我们在临床上使用枯草芽孢杆菌做微生态制剂时，应注意其与抗菌药物的配伍禁忌，以防止由于细菌对抗菌药物的敏感作用而影响枯草芽孢杆菌作为添加剂的活性和功效。3.3 安全性分析枯草芽孢杆菌在大多数动物肠道内被认为是过路菌17，但在牛粪中分离到该菌，说明该菌对反刍动物的消化吸收有一定作用。为了验证枯草芽孢杆菌作为微生态试剂的安全性，利用该菌做了安全性试验，用浓度约为1011cfu/mL菌液灌服空腹8h的小鼠，两周后小鼠没有死亡，剖检观察小鼠腹腔和胸腔的器官也无病变，说明我们分离得到的枯草芽孢杆菌有较高的安全特性，为此菌作为微生态制剂的研究提供了有利的依据18。4 结论本试验从健康奶牛粪便中分离纯化出1株枯草芽孢杆菌，命名为K，为反刍动物专用微生态制剂的研究奠定良好基础。参考文献： 1 Singh V P，Sharma J，Babu S，et al.Role of probiotics in health and disease：a review J.J Pak Med Assoc，2013，63（2）：253-257.2 Jirillo E，Jirillo F,Magrone，T.Healthy effects exerted by prebiotics，probiotics，and symbiotics with special reference to their impact on the immune system J.Int J Vitam Nutr Res，2012，82（3）：200 -208.3 李桂杰，张钧利.动物微生态制剂的研究进展J.饲料工业，2000.21(11):16-18.4 张以芳.微生物饲料的应用现状及前景J.中国饲料，2001，3:12-13.5 张日俊.动物胃肠道菌群与其免疫功能和健康的关系J.饲料广角，2002，（21）:17-206 王建辉，陈立祥，贺建华.益生素的不同作用机理探讨及其在动物生产中的应用J.饲料工业，2003,12