GMP工程硕士课件生物技术制药个论.ppt

生物技术制药个论,基因工程制药抗体制药动物细胞制药植物细胞制药酶工程制药现代生物技术改造传统制药工业,一、基因工程药物种类,细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、凝血因子蛋白质类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。溶血栓药物：组织型纤溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体型其他：血红蛋白、白蛋白等。,重组蛋白质类药物,核酸类药物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用，它通过纠正突变的基因并使之重新获得适当的功能来治疗或预防疾病。特点是：能将基因表达的产物的作用局限于病变组织周围，从而使治疗更具针对性；只要转化细胞不被清除，转化的因不被抑制，基因表达的产物就可以持续发挥作用。,核酸类药物,从根本上解决了某些药物的生物原料适应证不断延伸技术含量高加速疑难病症新药物的开发,基因工程药物的特点,确定研制基因工程药物的技术路线基本技术路线1：获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因组入表达载体受体细胞高效表达动物试验临床试验申报新药证书基本技术路线2：基因组未知功能的人类基因全长cDNA群组入表达载体受体细胞瞬间表达功能初筛功能验证重组蛋白表达体内外药效分析临床前研究临床验证申报新药证书,二、研制基因工程药物的关键技术,优点：目的明确。缺点：发现新药的机率低，在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。,建立在庞大人类基因资源基础上的，具有巨大的开发潜力，缩短新药开发的时间，可大规模增加新药的数量。,宏观：在分子水平上，采用类似于工程设计的方法，按人类的需要产生不同的基因产物或定向的创造生物的新性状，使之稳定地遗传给子代。微观：将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新性状。供体、受体、载体无性繁殖：称之为“克隆”行使正常功能：称之为“表达”,基因工程的定义,在体外，将各种来源的DNA片段与载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。DNA片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的载体DNA：病毒、细菌质粒或噬菌体,生物化学角度：重组载体的操作,上游技术（upstream）-上游技术十分重要重组子的构建工程菌的构建及高效表达下游技术（downstream）-下游技术更为重要工程菌大规模发酵最佳参数的确定新型生物反应器的研制高效分离介质及装置的开发分离纯化的优化控制生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造超滤、反渗透技术的应用我国现代生物技术与国际水平相比上游技术落后35年下游技术落后15年以上,基因工程技术,工程菌构建流程,选择载体获得目的基因目的基因与载体的重组重组载体的转化重组子的筛选与鉴定,基因工程上游技术基本过程,质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒（virus）,载体（vector）,载体的条件分子小（10Kb）有限制酶酶切位点可自主复制有足够的copy数带筛选的标志,限制性核酸内切酶restrictionendonuclease,一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶特异核苷酸序列大多为46bp回文对称（palindromesequence）5GAATTC35GGATCC33CTTAAG53CCTAGG5,宿主细胞,原核细胞：细菌、枯草杆菌酵母：酿酒酵母，必赤酵母植物细胞:昆虫细胞：哺乳动物细胞：,糖尿病到胰島素治療,ameltingdownoffleshandlimbsintourine.andthatisthereasonwhythesicknesshasbeencalleddiabetes,asifitwereawinesiphon,becauseliquidisnotretainedinthebody.(ca.81-138A.D.)1674ThomasWillis發現患者尿液有甜味，稱之“diabetesmellitus”.1776MatthewDobson取患者尿液殘餘物證實為糖。PaulLangerhans(laterhalfof19thcentury)describedisletcells-secreteglucoseloweringsubstance1922BantingandBestdiscoveredinsulin.,T-JWu,Discoveryofinsulin,Banting&Best-extractedinsulinfromdogs&provedthatitcontrolssymptomsofdiabetesindogs1921,1stpatienttoreceivepancreaticextract-14-yroldLeonardThompson.Firstpatienttobenefitfrominsulinsavedfromdeath.,胰島素(Insulin)與諾貝爾獎,由於首次在人以胰島素成功地控制糖尿病1923諾貝爾獎頒給Banting與Macleod。1955FrederickSanger闡明胰島素結構(A鍊21a.a.與B鍊30a.a.)，1958因此獲得諾貝爾獎。1959SolomonBeson與RosalynYalow開發出免疫測定技術(immunoassaytechnique)，Yalow也於1977獲得諾貝爾獎。,ManufactureofInsulin,1923-startedmanufacturinginsulin(EliLilly,Novo)MostdevelopmentsininsulintherapyhaveoriginatedfromthelaboratoriesofNovo-NordiskNPHinsulinhighlypurifiedinsulinmonocomponentinsulinsemisyntheticinsulinbiosynthetichumaninsulinCurrentlyNovoNordiskmanufactureshumaninsulinfrombakersyeastusingrDNAtechnology；EliLillyproduceshumaninsulinusingE.coli.,ImprovementofinsulinQuarlity,ProblemswithEarlyPreparationsCrudehighlevelsofnon-insulin-likeimpuritiesProinsulin,proinsulinintermediate,covalentinsulindimerAcidicpH4-4.3-painduringinjectionHighincidenceofallergicreactionsShortdurationofaction(moreno.ofinjections)BetterPurificationmethodsConventional:isoelectricprecipitationandrecrystallization,Imp:10000-30000ppmSinglepeak:bygel-filtrationchromatography,(Imp300-3000ppm)Improvedsinglepeak:byion-exchangechromatography,(50ppm)Highlypurified:twicechromatographedinsulin,(purifiedto10ppm)Monocomponent:Imp1ppm,Historyofinsulinpreparations,1922:Isolationofinsulin1923:NovoNordiskstartsproductionofinsulin1946:NPH(NeutralProtamineHagedorn)orIsophaneinsulin1961:Firstneutralsolubleinsulin:Actrapid1964:Firstpremixedinsulin:Mixtard1973:Monocomponent(MC)purity1982:HumanMonocomponentHM1985:NovoPenwithPenfill1984:Researchonanalogues,胰岛素是由51个氨基酸组成的双链多肽激素，一种可溶性酸性蛋白，分子量为5734道尔顿；每个胰岛素单体包括两条肽链（A、B链），A链含有21氨基酸；B链含有30氨基酸并分别由两个胱氨酸的二硫键连接，多聚体必须裂解成单体才可吸收；呈酸性，等电点为5.3。胰岛素受pH值、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚。,Lispro由Lilly公司研发而成，是人胰岛素链上的第28位的脯氨酸和第29位的赖氨酸位置互换，其他的氨基酸序列和结构没有变化，以单体的形式存在.,速效胰岛素-Lispro赖脯胰岛素,1999年，Aspart在欧洲上市；2002年在我国上市，是由诺和诺德公司研发的速效胰岛素类似物，人胰岛素链28位的脯氨酸被天冬氨酸取代，使该胰岛素类似物不易形成六聚体。与Lispro相比，Aspart的吸收速度更快，对餐后血糖的控制、降低糖化血红蛋白效果更好。这种药代动力学的差异可能与它们的等电点不同有关。Aspart对酸化溶液沉淀蛋白的耐受度较高,速效胰岛素-Aspart门冬胰岛素,是Aventis公司正在研发的一种新型快速作用的胰岛素类似物，链3位的天冬酰胺被赖氨酸替代，而B链29位的赖氨酸则被谷氨酸取代。,速效胰岛素-Glulisine赖谷胰岛素,由Aventis公司研发的长效胰岛素类似物，2000年在美国和欧洲上市，于2003年在我国上市。和人胰岛素的区别在于A链羧基端的第21位天冬氨酸被甘氨酸替代，B链C末端加上2个精氨酸残基，。结构改变的结果是改变了胰岛素的等电点，由pH54升至67，使Glargine在生理pH条件下更难溶解、吸收更为缓慢，六聚体的结合更加稳定，无分泌峰值.,长效胰岛素-Glargine甘精胰岛素,由诺和诺德公司研制生产，结构上去除了人胰岛素B链29位赖氨酸E位以共价键结合一个N一16烷酸基的14碳游离脂肪酸，并去掉第30位的苏氨酸残基。与Glargine不同，Detemir溶液在皮下不会形成沉淀，因此吸收速率恒定,长效胰岛素-Detemir地特胰岛素,基因诊断genediagnosis,内在因素（主要是遗传因素）外在因素（环境因素）外在因素+内在因素,人类的疾病原因,狭义的概念对疾病或与致病相关的核酸片段（DNA或RNA）的确定及核苷酸序列的测定,广义的概念对疾病或与致病相关的基因（DNA）的表达产物（mRNA、蛋白质）的确定和序列测定,基因诊断的概念,基因诊断的特点,针对性强以探测基因为目标，属于“病因诊断”特异性高以分子杂交技术为基本原理灵敏度高基因探针带有十分敏感的检测标记，待测标本微量适应性强基因探针可为任何来源，任何种类，探针序列可为已知亦可未知，检测目标可为特定的基因或基因组合，可为内源基因亦可外源基因，诊断范围广,与疾病相关的DNA分子（片段）及其核苷酸序列的确定和检测疾病基因疾病相关基因,基因诊断的基础及其核心问题,基因诊断的途径,基因突变的检测基因连锁分析：连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（RFLP）为遗传标志进行家系分析在人类基因组中，平均约200bp可发生一对变异（称为中心突变）。中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性用该限制酶水解DNA就会产生长度不同的片段，称为RFLPmRNA的检测：mRNA检测是基因诊断的重要方面，其不仅从基因表达水平提供基因功能是否正常的直接依据，而且在基因诊断上具有以下优点：mRNA相当于以基因为模板的扩增产物，因此检测mRNA灵敏度比检测DNA更高mRNA不含内含子，比DNA容易检测,限制性核酸内切酶酶谱分析核酸分子杂交限制酶片段长度多态性连锁分析聚合酶链反应（PCR）DNA芯片技术,基因诊断方法,基因诊断应用,在遗传性疾病和产前诊断中的应用血红蛋白病杜氏肌营养不良症苯丙酮尿症脆性X综合症,在感染性疾病诊断中的应用病毒细菌螺旋体支原体衣原体寄生虫,基因芯片(DNAchipormicroarray),DNA芯片（或基因芯片）是将许多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段（称为探针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面,基因芯片技术流程,一、基因芯片原理及制备方法原位合成：寡核苷酸芯片，采用光导化学合成和照相平板印刷技术，在固相介质表面特定区域合成已知序列的寡核苷酸，直接点样：寡核苷酸芯片和cDNA芯片已知基因序列通过在液相中化学合成，或通过PCR技术扩增，或克隆的基因组片段，经纯化及定量分析后，由点样机器人将靶基因序列直接点到预先经过化学修饰的基片上；然后将未结合的靶基因从基片上洗掉，就得到基因芯片。,数据分析、寻找差异表达的基因,Cy3标记A组织,Cy5标记B组织,混合探针,以两种波长的激光扫描,杂交,A,B,二、样本的制备、标记与芯片杂交,1.实验样本的制备常用的基因芯片实验样本是mRNA(cDNA)直接从组织或细胞中提取的mRNA利用PCR技术扩增出的cDNA2.探针的标记-荧光标记用花青素(cyanin)Cy3,Cy5进行双色荧光标记,其激发和发射波长分别是550/570,649/670当用mRNA作模板时,常用反转录方法进行直接标记3.芯片杂交,扫描仪激光共聚焦扫描光源：特定波长的光激发面积：100平方微米如：ScanArray3000CCD(电荷耦合摄像芯片扫描仪)光源：连续波长的光（如弧光灯）同时对整张芯片表面进行扫描,三图像与数据处理,芯片测序,药物研究,基因图绘制,农林业,表达分析,突变检测,军事、司法,疾病诊断,.,.,.,.,四、基因芯片的应用,基因治疗：指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。,将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一1991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功1994年，中国用导入人凝血因子基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者,腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5端与一种末端蛋白（TP）共价结合，5端上还具有末端反向重复序列。病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合腺病毒家族（Adenoviridae）的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地复制，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者。,腺病毒的一般特性,抗体工程制药,概述单克隆抗体鼠源性单克隆抗体的改造基因工程抗体和抗体工程抗体诊断试剂抗体治疗药物,从分子构成来看，抗体药物可分三类：（1）抗体或抗体片段。完整的抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、人源抗体；抗体片段包括Fab等。（2）抗体偶联物，或称免疫偶联物，由抗体或抗体片段与“弹头”药物连接而成，可用作“弹头”的物质有放射性核素、化疗药物与毒素。（3）融合蛋白，由抗体片段和活性蛋白两部分构成。,三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，该部位也称为互补性决定区重链和轻链的C区分别称为CH和CL，不同类Ig的重链CH长度不一，同一种属动物中，同一类别Ig分子C区氨基酸的组成和排列顺序比较恒定。铰链区位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。,根据氨基酸排列顺序的不同分为可变区（V）和恒定区（C）比较不同抗体V区的氨基酸序列，发现VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，这些区域称为高变区。,整体水平抗体生成技术,细胞工程抗体生成技术,基因工程抗体生成技术,多克隆抗体（抗血清）,单克隆抗体,嵌合抗体、改形抗体,“小型化抗体”（单链抗体）,组合抗体库技术,噬菌体抗体库技术,Ig基因转基因小鼠,抗体真核表达技术,用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3，而且鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。,单克隆抗体,单克隆抗体和多克隆抗体的制备,改造鼠源性单克隆抗体的目的：一是降低免疫原性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。如将鼠源性单克隆抗体的C区用人的Ig分子的C区置换，则对人的免疫原性消失。对鼠源性抗体的改造已有很多成果报道，改造后的单抗的类型和特性：鼠源单抗的改造随基因工程的发展经历了人鼠嵌合抗体（人IgC-小鼠IgV，150000）、人源化单克隆抗体及人源性单克隆抗体三个阶段改形抗体（将小鼠CDRs替换为人CDRs，150000）Fab(完整L链和Fd，50000）FV（VH和VL，25000）单链抗体（SCFV，VH-多肽-VL，27000）单域抗体（VH或VL，12500）最小识别单位（MRU）（一个CDR，2000）。,鼠源性单克隆抗体的改进,人源化单克隆抗体的设计与开发的技术流程:包括靶分子的挑选、抗体人源化、人抗体制备、抗体基因克隆、抗体库构建、抗体筛选、抗原表位预测、建模分析、动物模型研究、临床试验、抗体表达载体构建、细胞培养等。抗体人源化方法可供选择：一是鼠抗体人源化。具体技术包括嵌合抗体、表面重塑抗体、重构抗体；二是全人源化抗体。包括抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人源化抗体、转染色体牛等。目前抗体药物研发中尚待解决的问题:包括靶分子的挑选，抗体人源化及人抗体制备，抗体基因克隆及抗体库构建，抗体的高通量大规模筛选技术，抗原表位的预测、模建和分析技术，抗原抗体相互作用的立体模型构建，抗体体外亲和力成熟，各种增加抗体效应功能的技术，抗体的高通量大规模筛选技术，动物模型反应与人体反应一致性，抗体高效表达载体构建和动物细胞规模化培养技术等。,人源化单克隆抗体的设计、优化和临床试验,抗体设计和优化需要大量应用蛋白质工程方面的计算机分子结构模拟技术、组合化学技术和分子进化技术,动物细胞制药与细胞治疗,动物细胞改造与蛋白质药物生产人细胞改造与疾病治疗,原代细胞已建立的二倍体细胞系可无限期传代的转化细胞系基因工程细胞,生产用动物细胞要求和获得,基因工程细胞系的构建：1、真核细胞基因表达载体的构建2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选,为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本条件：（1）绝对无菌操作；（2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入；（3）适量氧气供应；（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物；（5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度等；（6）及时分种，保持合适的细胞密度。,动物细胞培养的方法和操作方式,从生产实际来看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。无论是哪种培养，其操作方式与细菌培养一样，一般可分为分批式操作、补料-分批（或流加式）操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作，其中分批式、半连续式和灌流式比较重要。目前生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌式生物反应器和气升式生物反应器。贴壁依赖性细胞，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度。,动物细胞培养的方法和操作方式,植物细胞的形态和生理特性植物细胞培养的基本技术影响植物次级代谢产物累积的因素植物细胞培养的生物反应器进展与展望,植物细胞制药,高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。目前已经研究过的近300种植物细胞培养物可以生产400多种人们感兴趣的成分。植物无菌培养技术分如下几类：幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（plantculture）；愈伤组织培养能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为“悬浮培养”（suspensionculture）；离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为“器官培养”（organculture）；未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为“胚胎培养”（embryoculture）。,植物无菌培养技术,1、