第六课 离心吸附柱法回收琼脂糖凝胶DNA

.,第六课,离心吸附柱法回收琼脂糖凝胶电泳DNA,.,实验原理,离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低PH值、高浓度盐（盐酸胍，NaI,NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程，提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已经有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。,.,试剂盒组成及储存方法,.,实验步骤,DNA电泳结束后，在长波紫外灯下，用洁净刀片在切出所需DNA条带。尽量将胶块中无DNA部分去除掉。含DNA的琼脂糖凝胶块装入1.5ml离心管，12000rpm离心1分钟。估算凝胶体积（正常情况下应称重确定凝胶量）。加入3倍凝胶体积的溶胶/结合液DB。56水浴10min（或直至胶完全溶解），每隔2-3min取出混悬震荡10秒，加速琼脂糖凝胶溶解。每100mg凝胶加入150l的异丙醇，震荡混匀。加入异丙醇可提高回收率。回收大于4kb的片断不必加异丙醇。将融化的胶液转移至插入收集管的吸附柱AC内，12000rpm离心1分钟，弃去收集管内废液，再将离心柱插入收集管。如总体积超过750l，可分次将溶液加入同一吸附柱AC中离心。加入漂洗液WB700l（确认已加入无水乙醇！），12000rpm离心1分钟，弃去收集管内废液，将吸附柱AC插入收集管。加入漂洗液WB500l，12000rpm离心1分钟，弃去收集管内废液，将吸附柱AC插入收集管。12000rpm离心2分钟,以尽量除去漂洗液，以免漂洗液中的残留乙醇抑制下游反应。将吸附柱AC插入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中心位置加入30l洗脱液（H2O,pH8.5），不要触及硅胶膜。室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟。将得到的洗脱液重新加入吸附柱AC，12000rpm离心1分钟可使洗脱更为充分。-20保存。,.,实验步骤DNA琼脂糖凝胶电泳,用1XTAE配制1%的琼脂糖凝胶。置微波炉中加热至沸腾,琼脂糖完全溶解。100ml凝胶中加入5ulDNA染料（GoldView）。待稍冷却后制备DNA检测用凝胶。待凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中。在电泳槽中加入1XTAE至液面恰好漫过凝胶表面。吸取5l纯化的DNA与1l6X电泳样品缓冲液混匀。将样品加入电泳凝胶的样品孔中。在实验组样品旁的样品孔中加入6lDNA分子量标准品。在加样孔侧接负电极，相反方向接正电极，以135V的恒定电压电泳30分钟。电泳结束后，将凝胶取出，置紫外灯箱上观察质粒DNA的电泳情况。,.,注意事项,切胶回收DNA时，应尽量使用能量较低的长波长紫外线，并缩短操作时间，以减少紫外线对DNA的损伤。第一次使用前先在漂洗液WB中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记，以免多次加入。在低温时溶液可能形成沉淀，使用前在37加热使溶液澄清。待溶液恢复到室温后使用。各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。如纯化的DNA片段大小在100bp到50kb之间，起始量在5g-25g之间则回收率可达85%-95%。否则回收效率将大大降低。如DNA和结合液混合后PH值7.5，溶液保持黄色，吸附膜吸附DNA的效率最高。如果溶液变成橘红色或淡紫色，则说明PH偏