蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法

.,蛋白质含量测定考马斯亮蓝法,实验十一,.,实验目的,掌握考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量的原理和操作步骤;进一步熟练分光光度计的原理和操作方法;掌握标准曲线的制作和使用。,.,双缩脲（NH3CONHCONH3）：凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。Folin酚试剂法（Lowry法）Folin酚试剂中的磷钼酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物），在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。该法的灵敏度是双缩脲法的100倍.1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法:染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比，灵敏度高比Lowry法约高四倍,.,实验原理,1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一.考马斯亮蓝G-250染料，在游离状态下呈棕红色，在酸性溶液中当它与蛋白质结合后，变为蓝色，使染料最大吸收峰位置，由465nm变为595nm。在595nm测定的吸光度，与蛋白质浓度成正比。,.,CoomassieDye-Based蛋白质定量,.,Bradford法的突出特点:(1)灵敏度高。其最低检测蛋白质含量可达1mg，这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数。(2)测定快速，简洁，完成一个样品的测定，只要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟,其颜色在1小时内保持稳定（在5-20分钟之间，稳定性最好）(3)干扰物质少。,.,缺点:(1)各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此不同蛋白质时有较大的偏差；(2)有一些去污剂等物质干扰此法的测定；(3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。此方法灵敏度比紫外吸收法高10-20倍。凯氏定氮法比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质.,.,器材与试剂,可见光分光光度计试管标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA）配置考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。,.,(三)操作方法,(1)取6支试管编号，1支作空白，4支加标准蛋白溶液，1支留作未知样品。分别加入各种试剂：,.,(2)加完试剂混匀，2-5分钟后即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值，空白对照为1号管。用标准蛋白质为横坐标，用吸光值A595为纵坐标，作图，即得一标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品吸收值，即可查出样品蛋白质含量。,.,标准曲线的制作,坐标纸法电脑软件法,.,(1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能的最低与最高值，可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。(2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。(3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。用普通方格纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。,标准曲线的制作-坐标纸,.,绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点为此座标标点。将各座标点和原点联成一条线，若符合朗伯比尔定律，则通过原点的直线。若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀分布在直线的两边。绘制完毕以后，在座标纸上注明实验项目的名称，比色计的型号和仪器编号、单色光波长、日期等。一般作2-3次以上的平行，重复性良好曲线方可。绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。,.,电脑作图-Excel为例,首先，将数据整理好输入Excel，并选取完成的数据区，并点击图表向导；点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选“XY散点图”，并选了图表类型的“散点图”点击“下一步”，如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击“系列”来更改.,.,完成了散点图，现在需要根据数据进行回归分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。其实这很简单，先点击图上的标准值点，然后按右键，点击“添加趋势线”。点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，在显示公式和显示R平方值（直线相关系数）前点一下，勾上。再点确定。公式和相关系数都出来了。,.,.,四.注意事项,（1）如果测定要求很严格，可以