粮油检验-维生素

2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,1,第七节 食品中维生素的测定,一、概述 生物体的生理生化反应都是在酶系统的催化作用下进行的，一些酶的催化体系包括小分子辅酶或辅基，而一些维生素就是辅酶或辅基的组成部分，如是羧化酶辅酶，是黄素蛋白的辅基。粮食、食品和饲料中的维生素含量极少，但对动物来说是非常重要的。因为，动物体内不能合成维生素，必须从食品或饲料中摄取，当摄入量不足时会出现维生素缺乏症，而过量摄入维生素，会产生中毒。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,2,第七节 食品中维生素的测定,1.维生素分类 维生素按溶解特性划分，可分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类。 水溶性维生素有：硫胺素、核黄素、泛酸、维生素B6、叶酸、生物素、抗坏血酸、烟酸。 脂溶性维生素有：视黄醇、钙化醇、生育酚、抗出血维生素。 除维生素外，还有一些维生素的前体物，如胡萝卜素，即为维A原，在生物体内可以转变成维生素。 现在工业化生产中，还有作为添加剂使用的维生素衍生物。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,3,第七节 食品中维生素的测定,2. 维生素类添加剂 在食品和饲料中，除天然维生素以外，为了强化营养、增加抗氧化能力，常常还要添加一些维生素的衍生物。 维生素A醋酸酯、维生素A琥珀酸酯 硫胺素十六烷基硫酸盐、硫胺素-1，5-二磺酸盐、月桂基硫酸盐二苯硫胺素 核黄素磷酸酯钠、核黄素酪酸酯 抗坏血酸硬脂酸钠,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,4,第七节 食品中维生素的测定,3.维生素的特性 一般来讲，维生素对外界因素的影响非常敏感，在提取、测定及样品保存过程中要特别注意。 酸 碱 氧 光 热维生素A 维生素D 维生素E 维生素K 维生素B1 维生素B2 维生素B6 泛酸 叶酸 维生素B12 维生素C 维生素PP生物素,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,5,第七节 食品中维生素的测定,4.维生素的测定方法 粮食、食品和饲料中的维生素的主要有：高压液相色谱法、荧光分光光度法和比色法，微生物法已逐步被淘汰。其中，高压液相色谱法以其高分离能力、高灵敏度的检测，被广泛地应用。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,6,第七节 食品中维生素的测定,二、维生素A和维生素E的测定 维生素A、维生素E都是脂溶性维生素，它们对光、氧很敏感，在提取和测定过程中，要避光、隔氧进行，否则，它们迅速被氧化分解，使测定结果偏低，甚至测不到。 维生素A只有动物性食品中含有，维生素E在动物性、植物性食品中都含有。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,7,二、维生素A和E的测定,(一)高压液相色谱法1. 原理 将样品中油脂皂化，用脂溶性溶剂提取维生素A和维生素E，采用高压液相色谱仪分离分析。色谱条件为C18柱，紫外检测器，反相色谱法进行分离，以苯并芘为内标物，内标法定量。 高压液相色谱法分析维生素A时，采用正相色谱法和反相色谱法都可以进行。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,8,二、维生素A和E的测定,2. 色谱分离系统选择 如果采用正相色谱法，色谱柱主要是硅胶柱，而流动相是以正己烷为基本溶剂，加适量异丙醇、乙醚、正辛醇等试剂调节流动相极性。这样的色谱条件要求样品提取液应不含水和碱性成分。 如果采用反相色谱法，色谱柱主要是C18柱，而流动相是以甲醇、乙腈为主要溶剂，水为极性调节剂的溶剂系统。样品提取液中的极性成分对反相色谱法的柱效影响不大，对于一些维生素含量高的样品，可以直接用油样或脂溶性溶剂的抽提物进行分析。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,9,二、维生素A和E的测定,3.分析维生素A或维生素E的色谱条件1）用于分析维生素A的HPLC系统2）用于分析维生素E的HPLC系统,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,10,二、维生素A和E的测定,4.分析步骤 皂化 提取 洗涤 干燥 浓缩 定容 离心 色谱分析 结果计算,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,11,二、维生素A和E的测定,5.测定过程中的必须注意： 样品制备、前处理过程中要避光、加抗氧化剂VC操作，必要时用氮气隔离氧。 在进行色谱分析时，所用试剂纯度要分析纯以上，否则，可能带来新的干扰。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,12,二、维生素A和E的测定, 试剂、样品提取液必须用超滤膜进行过滤，将固体、流动相不溶性的胶体过滤掉。 对于分离不太好的结果，要正确选择色谱数据处理方法。 具有很强分离能力的色谱柱，可以将维生素A、维生素E的异构体分离，这时应对各异构体分别定量。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,13,二、维生素A和E的测定,（二）比色测定法维生素A 1.原理 维生素A在三氯甲烷溶液中，与三氯化锑作用生成蓝色物质，用分光光度计，于620nm波长处测定吸光度值。 使用该方法测定维生素A时，维生素A的各种异构体、胡萝卜素及类胡萝卜素都可以与三氯化锑呈蓝色反应，这种蓝色物质在6秒钟内稳定。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,14,二、维生素A和E的测定,2.注意 由于显色后不能有较长的稳定时间，测定误差很大，必须由操作熟练的人员测定。 三氯化锑遇水产生白色沉淀，测定用样液必须彻底脱水。 这种方法所测的是维生素A及A原的总量。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,15,第七节 食品中维生素的测定,三、胡萝卜素的测定 胡萝卜素是维生素A原，胡萝卜素有多种异构体，其中，-胡萝卜素的生理效价最高，其次是-体和隐黄素。-胡萝卜素显深桔红色，它既可以作为营养强化剂，也可以作为食用色素。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,16,三、胡萝卜素的测定,1.原理 食品中胡萝卜素以及其它色素用乙醚和丙酮提取，然后以石油醚为展开剂，进行纸层析分离。 胡萝卜素分子极性最小，比移值最大，层析结束后，将胡萝卜素谱带剪下，用溶剂洗脱，再用分光光度计于450nm波长处测定吸光度值，标准曲线法定量。该方法的最小检出量为0.11g。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,17,三、胡萝卜素的测定,2.操作流程 样品处理 提取 洗涤 浓缩 干燥 纸层析 洗脱 测定 结果计算,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,18,三、胡萝卜素的测定,3.测定方法 1）样品前处理 （1）样品需经低温干燥，以避免胡萝卜素被氧化。 （2）对于低脂肪的果蔬类样品，可以直接丙酮-石油醚混合溶剂提取；植物油和高脂肪含量样品，必需经过皂化，去除脂类的干扰，然后用石油醚提取。 （3）提取液还需要反复用硫酸钠水溶液洗涤，直至下层水溶液清亮为止，提取液还必须用水洗至中性，用无水硫酸钠干燥提取液 （4）提取液减压浓缩干，然后重新定容，备用。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,19,三、胡萝卜素的测定,2）层析 （1）吸取浓缩样液，点样。 （2）以石油醚作为展开剂进行层析。 （3）层析分离后，剪下位于展开剂前沿的胡萝卜素色带，立即放入石油醚溶剂中洗脱。 3）测定 选择450nm的光为测定波长，以石油醚调节分光光度计的零点。测定标准系列，绘制标准曲线。测定样液的吸光度值，查标准曲线进行定量。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,20,第七节 食品中维生素的测定,四、硫胺素的测定 硫胺素属于水溶性的维生素，在碱性条件下不稳定。测定硫胺素时，可采用经重氮化反应后的比色法进行，也可以采用在碱性条件下，用铁氰化钾氧化为硫色素，进行荧光法或高压液相色谱法分析。还有采用紫外分光光度计直接测定硫胺素或焦磷酸硫胺素。 国标GB/T14700-93规定了饲料原料、配合饲料、维生素预混料等样品中维生素的测定方法。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,21,四、硫胺素的测定,1.原理 样品经酸水解、酶水解处理，用稀酸提取，提取液经人造浮石净化处理后，在碱性溶液中，高铁氰化钾将硫胺素氧化，生成一种具有蓝色荧光的硫色素。荧光法测定硫色素时，激发波长为365nm，发射波长为435nm。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,22,四、硫胺素的测定,2.人造浮石的活化 取一定量的人造浮石，以10倍其容积的3%热乙酸洗涤两次，再用5倍其容积的25%热氯化钾洗涤，再用3%热乙酸洗涤，最后用蒸馏水洗至没有氯离子，干燥后密闭保存。活化好的浮石，必须做回收实验，回收率要在92%以上。如果活力不够，要重新活化或增加25%氯化钾溶液的处理次数。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,23,四、硫胺素的测定,3.操作流程 水解、酶解样品 酸提取 净化 碱性氧化 荧光测定 结果计算 1）提取硫胺素 将样品粉碎加酸并打成匀浆，高压锅中高压酸解，冷却，加入糖化酶进行酶解。水解液过滤备用。 样品进行酸解和酶解的目的，是将结合的、被淀粉及蛋白质吸附的硫胺素释放。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,24,四、硫胺素的测定,2）硫胺素提纯 将滤液加到已装好浮石的柱子中，用热水淋洗两次，将提取液中的杂质洗脱。用一定量的热25%酸性氯化钾分次洗涤柱子，将被吸附的硫胺素洗脱，收集洗脱液，即为提纯的硫胺素。 硫胺素标准溶液必须过浮石柱子，以消除浮石柱子回收率低带来的影响。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,25,四、硫胺素的测定,3）氧化硫胺素 在样液管中，加15%氢氧化钠溶液，准确加一定量的正丁醇，加碱性铁氰化钾溶液，剧烈振摇，待分层后，取正丁醇溶液脱水。 在硫色素的生成过程中， 样品中含有还原性杂质时，铁氰化钾溶液的用量要适量增加。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,26,四、硫胺素的测定, 硫胺素的氧化、萃取同步进行，硫胺素被氧化后，生成憎水性的硫色素而进入正丁醇中，同时避免了硫色素被铁氰化钾的氧化。 可以使用二氯化汞和溴化氰作为氧化剂，这两种氧化剂的的氧化专一性比铁氰化钾高，如对N-甲基烟酰胺的氧化。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,27,四、硫胺素的测定,4）测定 用硫酸奎宁溶液校正荧光分光光度计。选择测定波长：激发波长365nm，发射波长435nm，分别测定空白试剂标准溶液、样品液的荧光强度值。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,28,四、硫胺素的测定,4.在使用荧光法测定中，影响测定结果的因素有：仪器的不稳定，引起荧光读数的波动。纯化硫色素时，浮石柱子的吸附活性不够高。氧化硫胺素时，过量的碱性铁氰化钾氧化硫色素。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,29,四、硫胺素的测定, 在硫色素的正丁醇溶液中的荧光淬灭剂，引起的荧光淬灭。引起荧光淬灭的因素： a.碘离子、溴离子、氰酸根离子是典型的荧光淬灭剂 b.荧光物质浓度太大时，溶液中溶质分子自撞。 C.正丁醇溶液的pH引起的荧光淬灭。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,30,第七节 食品中维生素的测定,五、荧光法测定核黄素 核黄素微溶于水，水溶液中呈黄绿色荧光，不溶于有机溶剂，在强酸中稳定，碱性溶液中光照易分解。核黄素的测定方法主要有直接荧光法、光黄素荧光法和高压液相色谱法。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,31,五、荧光法测定核黄素,1.原理 用酸水解样品，使VB2游离进入酸溶液中。经净化处理的提取液，用荧光分光光度计测定荧光强度。当用连二亚硫酸钠还原VB2为无荧光的物质后，测定样液中的荧光强度，还原前后荧光强度之差，即为样品中VB2的荧光强度，与标准比较定量。,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,32,五、荧光法测定核黄素,2.操作流程 酸水解样品 酸提取 氧化 柱层析净化 荧光测定 还原核黄素 荧光测定 结果计算,2018/2/12,国家粮食储备局标准质量中心,33,五、荧光法测定核黄素,2.操作步骤 1）VB2提取 样品用盐酸水解，水解液调节pH值，以