微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程

微生物菌种冷冻干燥低温冷冻保存技术规程范围1本程序明确了冻干和低温冷冻保存技术的定义、原理、技术要求、方法和步骤。此程序适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母、丝状真菌、担子菌等微生物种类的保存。有关病原微生物和其他需要特殊操作技术的微生物，请参阅相应的技术规定。2规范参考文件以下文件中的条款通过本规格的参考成为本规格中的条款。注释中包含的所有文件的后续修订(勘误表除外)或修订不适用于本规范，但是我们建议根据本规范签订合同的所有方研究文件的最新版本是否可用。没有日期的所有参照文件的最新版本将应用于此规范。国务院订单424号病原微生物实验室生物安全管理条例GB19489实验室生物安全一般要求科技部自然科学技术资源平台联合管理办公室文件自然科学技术资源共同说明规范(示范)3术语和定义以下术语和定义适用于此规范：3.1冷冻干燥自由驱动(freeze-drying)冷冻微生物，在减压下利用升华作用去除水分，中断细胞的生理活动，维持长期生存状态。3.2液氮低温保存preservationinliquidnitrogen液氮低温保存技术是在-196 的液氮或-150 的氮气中长期保存菌种的方法，利用微生物有效地保存-130 以下有新陈代谢中断倾向的微生物。3.3-80低温冷冻保存preservationin-80 c将菌种保存在-80 冰箱里，减缓和冷冻细胞生理活动的保存方法。4个内容4.1微生物菌种冻干保存技术规程4.1.1好氧细菌冷冻干燥管的制备4.1.1.1安瓿管准备安瓿管材料是中性玻璃好。清洗安瓿时，首先用2%的盐酸浸泡一夜，将自来水清洗干净，用蒸馏水浸泡在pH中性中干燥，贴上标签，标记细菌编号及时间，脱壳后，在121 等待高压灭菌15-20分钟。4.1.1.2选择和准备保护剂保护剂类型应根据微生物类别选择。配制保护剂时，要注意其浓度、pH值、灭菌方法。像血清一样，可以过滤灭菌。牛奶先除油，上层用离心力去除，一般在100 间歇2-3次，每次煮10-30分钟准备。4.1.1.3冷冻干燥样品的制备在最适当的培养条件下，将细胞培养到静止期或成熟期，然后进行纯度检查(见科技部自然科学技术资源平台联合东莞利萨索文件微生物菌种纯度检测技术规程(示范)，然后与保护剂混合装扮。微生物培养物浓度如果细胞或孢子在108-1010 /ml以上，则合适(以大肠杆菌为例，每1010毫升生体额为2毫升-2.5毫升，为了获得2-2.5毫升，每2个琼脂斜面为10毫升)。使用较长的毛细管滴管，直接落在放大器底部，注意不要打翻上方管壁，每个管的装扮量约为0.1-0.2ml，球形放大器的一半球量。在液体培养的微生物的情况下，要用离心力去除培养基，然后将培养物和保护剂混合在一起，保存在安波儿管里。最好尽量缩短安珀启动时间，在1-2小时内化妆，提前冷冻。化妆时要在无菌状态下操作。4.1.1.4预先冻结一般预先冻结2小时以上，温度在-20 到-35 左右。4.1.1.5冷冻干燥使用冷冻干燥机进行冷冻干燥。冷冻后，将样品放大器放入冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。干燥结束时间应根据以下条件判断：安瓿冻干物质呈脆的或疏松的片状真空度接近空载时的最高值样品温度接近管外温度选择1-2个对照组。其水分与细菌悬浮液的数量相同，被视为干燥完成安瓿管选择、深蓝色等1-2%的氯化钴可以视为干燥完成冷冻干燥后，取出样品放大器，放入烘干机内备用。4.1.1.6真空密封和真空检查将安瓿颈用强火焰细拉，然后用真空泵在真空中加热安瓿颈，使其熔化。熔化的干燥管可以使用高频电火花真空分析仪测量真空度。4.1.1.7保留安瓿要低温避光保存。4.1.1.8质量检查冷冻干燥后提取多种安瓿，进行存活率、产能、形态变异、杂细菌污染等各种指标检查。4.1.2厌氧冷冻干燥管的制备主要程序与需要氧的细菌相同4.1.2.1安瓿管准备请参阅4.1.1.14.1.2.2选择和准备保护剂使用保护剂之前，要在100 的沸水中煮15分钟左右，脱气后放入冷水中，迅速冷却，去除保护剂的溶解氧。4.1.2.3冷冻干燥样品的制备请参阅4.1.1.34.1.2.4预先冻结请参阅4.1.1.44.1.2.5冷冻干燥请参阅4.1.1.54.1.2.6真空密封和真空检查请参阅4.1.1.64.1.2.7保留请参阅4.1.1.74.1.2.8质量检查请参阅4.1.1.84.1.3冷冻干燥法的适用范围适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、真菌、酵母等的保存，但不适用于真菌的菌丝体、蘑菇类、鸟类、原生动物等。4.1.4保留期根据微生物复苏周期，一般10年左右。4.1.5恢复方法首先用70%酒精棉擦拭放大器顶部加热放大器管的顶部，在杀菌的棉棒上沾上冷水，摩擦上面部分，上面有裂纹，用挫刀或镊子颈轻轻敲，敲打裂开的放大器上面部分，用无菌水或培养液溶解菌块，使用灭菌吸管移至新鲜培养基，进行适当的温度培养。4.2微生物菌种低温冷冻保存技术4.2.1液氮低温保存技术4.2.1.1安瓿或冷冻保存管的准备使用圆形底部硼硅酸盐玻璃产品的安瓿管或螺旋塑料冷冻管。玻璃管应该没有裂缝。将冷冻保管管或放大器洗干净，在121 高压灭菌，等待15-20分钟。4.2.1.2准备保护剂保护剂类型应根据微生物类别选择。配制保护剂时要注意其浓度，一般使用10-20%的甘油。4.2.1.3微生物保存准备微生物的不同生理状态影响存活率，一般使用静止期或成熟期培养物。组装时要在无菌状态下操作。菌种制备可以使用多种方法：刮除培养物斜坡上的孢子或菌体，与保护剂混合，然后加入冷冻保管管。接种液体培养基，振动培养后混合细菌悬浮液和保护剂，安装在冷冻保管管内；在培养皿中培养培养培养物，形成菌落后，用无菌冲孔机在平板上切割大小均匀的小块(直径约5-10毫米)，真菌最好将菌落边缘的细菌取出，与保护剂混合，放入冷冻保管管。将1.2-2ml琼脂培养基放入小安瓿中，接种菌株，2-10天后添加保护剂保存。4.2.1.4预先冻结预先冻结时，一般的冻结速度调节最好每分钟降低1 ，使样品冻结-35 。目前有三种常用的温度控制方法。程序温度控制冷却方法，使用电子计算机程序控制冷却设备，可以保持持续冷却，控制好冷却速度。段冷却方法：在温度等级不同的冰箱或液氮罐部分冷却蘑菇，或在挂在冰上的气雾中慢慢冷却。安瓿管或塑料小管一般采用两阶段温度调节方式，放在-20 40的冰箱里1 2小时，放在液氮罐里快速冷冻。这种冻结速度以每分钟大约1-1.5 的速度下降。耐低温微生物可以直接放在气相或液态氮中。4.2.1.5保留将安瓿或塑料冷冻保管管存放在液氮罐中。一般气象上的温度为-150 ，液体的温度为-196 。4.2.1.6保留期一般10年以上。4.2.1.7恢复方法从液氮瓶中取出安瓿或塑料冷冻保管管后，应立即放入38 40的水浴中，迅速复苏，适当摇晃。内部结冰通常需要50-100秒左右，直到全部融化。打开安瓿或塑料冷却管，将内容物移到适当的培养基中培养。4.2.1.8服务范围各种微生物。4.2.1.9液氮保存应注意的问题。防止冻伤，操作安全，口罩和皮革手套塑料冷冻保管管必须拧紧螺母运送液氮时，必须用特殊容器运输，液氮不能用密封容器储存或运输，液氮不能用热水瓶储存注意保存液氮容器的室内通风，防止过量氮气窒息防止准备放大器1放大器或冷冻保管管4.2.1.14.2.2.2准备保护剂请参阅微生物保存准备请参阅4.2.1.34.2.2.4冻结4.2.1.24.2.2.3请参阅保留将安瓿管或塑料冷冻保管管保存在-80冰箱。4.2.2.5保留期通常1-5年。4.2.2.6复苏法管或塑料冷冻保管管爆炸，液氮侵入管等从液氮容器中去除时，液氮量膨胀约680倍，爆炸力很