PCR-DGGE技术

PCR-DGGE技术 一、实验原理 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE） 最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变 。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物 群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳 （TGGE）。该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目 前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。 双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于 其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的 DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE技术在一般 的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而 能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。 一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解 链区域和解链行为。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区 域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。当变性剂浓度逐渐增加达到 其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当变性 剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生 解链，从而双链DNA完全解链。 不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解 链区域的解链浓度也是不一样的。当进行DGGE电泳时，一开始变性剂 浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片 段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA片段迁 移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域 解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的 DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。因此同样长度但序列不同的 DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓 度，因此它们会在胶中不同的位置分开。 然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度 时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时他们又能在胶中 继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域 时，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC 片段可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链变性剂浓度很高，可以防止DNA片段在 DGGE胶中完全解链。当加入GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基 处的序列差异都能区分开来。 二、实验步骤 1.样品预处理 2.样品DNA的提取及纯化 提取方法根据各样品特点自主选择。 3. PCR扩增 Touchdown PCR method 用于DGGE的PCR引物及其扩增程序： （1） V3区的DGGE引物200bp左右的片段 正向引物：341F-GC(5- CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG- 3)；5 GC-clamp，有利于检测发生于高熔点区的突变. 反向引物： 518R (5GTATTACCGCGGCTGCTGG3) PCR条件： 10 x PCR buffer 2.5ul MgCl2(25mmol/L) 2.5ul dNTP(10mM/L) 0.5ul forward-pri(10pmol/ul) 0.5ul reverse-pri(10pmol/ul) 0.5ul Template DNA 12 ul add ddH2O to 25ul PCR程序： 94 5min （Taq added） 94 1min 65 1min 72 1min - 20 cycles 之后每两个循环降低复性温度1 - 94 1min 55 1min 72 1min 94 1min 55 1min 10 cycles 72 1min 72 7min （2） V3V5区的DGGE引物高于500bp的片段 Bacterial 正向引物341357：341F-GC(5- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG- 3)； 反向引物907926： 907R(5CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3) PCR程序： 94 5min （Taq added） 94 1min 65 1min 72 1min - 20 cycles 之后每两个循环降低复性温度1 - 94 1min 55 1min 12 cycles 72 3min 72 7min Archara 正向引物344363： ARC344F-GC（5- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGG YGCAGCAGGCGCGA-3） 反向引物915-934： ARC915R（5-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3） PCR程序： 94 5min （Taq added） 94 1min 65 1min 72 1min - 20 cycles 之后每两个循环降低复性温度1 - 94 1min 61 1min 12 cycles 72 1min 72 10min （3） V6V8区的DGGE引物480bp左右的片段 正向引物：968F （5- CGCCGGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTA 3） 反向引物： 1401R（5-CGGTGTGTACAAGACCC-3） PCR程序： 94 5min （Taq added） 94 1min 65 1min 72 3min - 20 cycles 之后每两个循环降低复性温度1 - 94 1min 55 1min 15 cycles 72 1min 72 10min 4.预实验（DGGE 条件优化） DGGE有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯 度或温度梯度的方向和电泳方向垂直；后者是指两个方向是平行的。在 分析微生物群落的 PCR 扩增产物时，一般先要用垂直电泳来确定一个 大概的变性剂范围。垂直电泳时，胶从左到右是变性剂梯度。在胶的左 边，变性剂浓度或温度低，DNA 片段是双链形式，因此沿着电泳方向 一直迁移。在胶的另一边，由于变性剂浓度或温度高，DNA 一进入胶 立刻就发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA 片段有不同 程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于 DNA 片段最低的解链区域 时，DNA 的迁移速率有急剧的变化。因此，DNA 片段在垂直胶中染色 后呈 S 形的曲线，根据垂直电泳确定的范围，再用水平电泳来对比分析 不同的样品。 5.制胶 （1）试剂配制 40% 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 (Acrylamide/Bis 37.5:1) Ragent amount Arylamide 38.96g Bis-acrylamide 1.04g Add ddH2O to 100ml 10% 过硫酸氨 (Ammonium persulfate) Reagent amount Ammonium persulfate 0.1g Add ddH2O 1.0ml store at -20 for about a week 50TAE Buffer Reagent Amount Tris Base 242g 121g Acetic acid glacial (冰乙酸) 57.1ml 28.55ml 0.5M EDTA pH8.0 100ml 50ml Add ddH2O to 1L to 500ml Store at room temperature Denaturant stock solution (8.0%) For 100ml use: 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 40% Acrylamide/Bis (ml) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 50TAE Buffer (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Formamide (ml) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Urea (g) 0 4.2 8.4 12.6 16.8 21 25.2 29.4 33.6 37.8 42 0% 25% 35% 45% 55% 65% 75% 40% Acrylamide/Bis (ml) 20 20 20 20 20 20 20 50TAE Buffer (ml) 2 2 2 2 2 2 2 Formamide (ml) 0 10 14 18 22 26 30 Urea (g) 0 10.5 14.7 18.9 23.1 27.3 31.5 （2）制胶 高浓度端：Syringe，高浓度胶 70% Denaturant/8.0% gel 10ml 14.5ml 20ml 24ml 10% APS 80l 116l 160l 192l TEMED 6l 8.7l 12l 14.4l 低浓度端：Syringe，低浓度胶 30% Denaturant/8.0% gel 10ml 10% APS 80l TEMED 6l 上相非变性胶 5ml 0% Denaturant/8.0% gel 40l 10% APS 3l TEMED （3）制胶步骤 按照Bio-Rad 475型梯度生成仪使用说明书操作。具体操作步骤见视 频教程及网上资源（Harvard）。 灌完胶后，立即用水冲洗注射器，避免凝固，并用水饱和正丁醇封 胶，使液面水平保持水平。 约凝固1h后，再用非变形胶灌注。 插入梳子，待凝固，出现缩胶补充。 （4）DGGE电泳条件 （根据不同PCR产物电泳条件不同） 水温：60 胶浓度：8.0%（丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 37.5:1） 变性梯度范围：30% - 70%（100%变性剂中含7mol/L尿素和40%去离 子甲酰胺） 上样量：15 - 20ul PCR产物 电压：200V 电泳时间：6h30min DGGE运行条件：1xTAE buffer，60，80V 运5min， 200V运行6.5h （5）染色 EB染色：染色20min，然后用去离子水漂洗几次，254nm紫外分析。 Bassam硝酸银染色步骤： 固定：10%的冰乙酸，30min （固定和终止共配置900ml） 洗脱：双蒸水洗脱，32min 银染：AgNO3 1g/L，37%的甲醛1.5ml/L，30min。配制500ml 洗脱：双蒸水，1min（沥干时间不要超过10s） 显色：30g/L Na2CO3，37%的甲醛1.5ml/L，200l 10g/L Na2S2O3。 10下预冷。配制800ml. 终止：10%的冰乙酸；5min 洗胶：用无菌双蒸水洗胶，33min 固定液：10%乙酸 900ml 90ml 100% + 810ml ddH2O = 900ml 10% 乙酸 银染试剂：1g/L AgNO3，1.5ml/L 37%甲醛 500ml（提前配制） 0.5g AgNO3 + 0.75ml 37%甲醛 + ddH2O定容至500ml 显色试剂：Na2CO3 30g/L，1.5ml/L 37%甲醛 800ml（使用前加入200l 10g/L Na2S2O3） 24g Na2CO3 + 1.2ml 37%甲醛 + ddH2O定容至800ml 0.01g Na2S2O3 + 1mlddH2O，用时取200l 6.样品的DGGE 分析 (1)切胶PCR-DGGE验证 用细菌的正向引物341357：341F-GC(5- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG- 3)、反向引物907 - 926：CCGTCAATTCMTTTGAGTTT；古菌的正向 引物344 - 363：ARC344F-GC（5- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGG YGCAGCAGGCGCGA- 3）、反向引物915-934：ARC915R（5- GTGCTCCCCCGCCAATTCCT- 3）扩增切取得条带，然后作DGGE电 泳看是否与原DGGE电泳位置一致，一致就作下面步骤。 (2)克隆测序 7.图谱分析和条带序列分析。 1、 Bio-rad QUANTITY ONE 软件对DGGE图谱分析 2、 Dice coefficient（戴斯系数）计算各样品间相似性 3、 HRT多样性指数分析，了解连续样品中菌落结构变化情况 4、 条带测序 构建发育树，进行系统发育分析 8.DGGE技术的缺陷及优化： 在用分子生物学方法分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不 同细菌的基因组大小和核糖体 RNA 拷贝数不同；提取基因组总 DNA 时细胞的裂解效率不同；DNA提取和纯化时有偏差；PCR 扩增过程中 有偏差。除了这些，在应用DGGE 技术分析微生物群落结构组成时还有 很多其他的缺陷。DGGE 一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片 段，因此得到的系统进化相关的信息就很少。在研究复杂环境生态系统 （如土壤，人体肠道）时，其中微生物种类很多。但DGGE图谱中一般 只有一二十个条带，这些条带反映的是群落中的优势菌群。一般只有在 总的微生物群落中占 1%以上的种群才能被检测出来，系统中的弱势菌 群不能被检测到。为了降低分析群落多样性时的复杂度，一种方法是先 根据 GC 含量的不同，将基因组总 DNA 分成各个部分，再分别 PCR- DGGE 分析。另一个方法是使用类群特异性（group-specific）引物对基 因组总 DNA 进行 PCR 扩增，再用于DGGE/TGGE 分析。在设计 PCR 引物去扩增某些特定菌群时，由于某些菌群的序列相互之间同源性不是 很高，因此需要设计简并性引物。此时，相同的微生物会有 2 个条带， 这会对微生物群落结构组成造成高估。另外，同一个细菌也可以有多个 核糖体 RNA 操纵单元，它们的序列可以有微小差异，这也会高估微生 物群落多样性。DGGE 的电泳条件不一样，即使相同的样品所得的图谱 也会有差异。在应用DGGE时，如果所用电压太低，需要的电泳时间就 很长，变性剂梯度会有变化，因此导致图谱也会有变动。另外，DGGE 的一个很大的优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究，得到它们的 序列，从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化 信息。以前研究DGGE胶中单一条带序列组成的一个比较普遍的方法是 先构建整个微生物群落的16S rRNA 克隆文库，然后再对文库中的克隆 进行扩增，通过DGGE 和原始样品的条带进行对比，能迁移到相同位置 处的克隆的序列就是原始条带所含的序列。然而，已有研究表明，不同 的 DNA 条带在DGGE 胶中可以迁移到相同的位置，因此单一DGGE 条 带可能含有不止一种序列。这种情形在分析复杂环境样品时会更多。另 一个研究DGGE/TGGE 胶中单一条带序列组成的方法是直接从胶中回收 DNA，然后