常规病理组织学和组织化学.ppt

实用组织化学技术、细胞化学和组织化学细胞化学化学化学系统使用细胞学、组织学、理化技术方法显示细胞组织结构的各种化学成分，定性、定位、定量(半定量)这些化学物质，分析细胞组织在生物体或病理状态下的代谢、功能和形态变化医学研究有广泛的应用价值。细胞及组织化学方法原则上使用已知的化学反应过程，使细胞组织内的各种化学物质形成当场看到的最终着色产物。光学显微镜观察显微镜细胞组织化学电镜观察电镜细胞化学免疫技术方法免疫组织化学电镜细胞化学细胞和组织化学方法细胞组织结构中各种酶的定性、位置、定量酶组织化学宏酶组织化学组织化学组织化学电镜酶组织化学、小脑挫裂伤、木质素-李红染色(HE)、组织化学方法组织细胞中的无机物质：主要是钾、钙、锌、铜、汞和其他金属；氯化物、磷酸盐等盐；各种武器放射性物质等。2.组织细胞中的有机物质：主要是中性脂肪、磷脂、胆固醇、中性和酸性粘多糖、糖原、粘液蛋白、淀粉、淀粉物质、淀粉、淀粉物质、黑色素、lipofin、胆汁色素、氨基酸、肽、蛋白质、DNA、蛋白质3.组织细胞中的各种酶：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、丁二酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等-蛋白。细胞和组织化学方法的特性：1。要最大限度地保存细胞和组织的各种化学成分和/或酶活性，以确保定性、定量研究；2.要最有效地维持细胞组织中固有的形态结构，确保化学成分和各种酶在细胞组织中的位置。要掌握试验中化学物质的特性，如水溶性、脂溶性、溶解度和特定反应。4.要掌握酶的检测功能、酶存在的特定部位、酶反应的适当温度和ph、酶的特定活性物质和抑制剂、影响酶活性的因素等各种酶的特性。5.必须做对照组实验，用阳性和阴性对照正确分析实验结果，认识假阳性结果。细胞和组织化学方法的基本技术，固定洗涤脱水透明蜡和内脏切片染色：脱蜡，脱苯，水合，染色，脱水，透明密封，第一，提取，基本要求：提取正确，适当，直接影响切片的制造和准确诊断。1.材质越快，越新鲜，越好，防止组织的自我溶解，腐败。刀要锋利，刀要垂直切。严禁使用钳子防止组织或细胞变形引起的人为损伤。3.采访尺寸，一般长度l-3厘米，宽度1-2厘米，厚度0.3-0.5厘米。科学研究用光学显微镜标本的直径不超过1cm 1cm 1厘米，电子显微镜标本的直径约为0.5毫米。过大尺寸的材质在短时间内不容易固定透针，会影响效果。4.病变部位和正常部位都要考虑。尽可能在低温下工作，0 4。器官特定的提取方法：脑：脑选择必须能够反映大脑各部分的变化，一般包括使用冠状动脉的整个脑(桥脑、延脑、小脑、脊髓和脉络膜)。材质如下：金额极；中央前后；海马；内部胶囊；领奖状；枕叶；脉络丛；中脑；桥脑；水质年初；小脑；脊髓颈部段。制作材料时必须包括烟幕和脑膜或烟幕(刀要锋利)。垂体：前、中、后、垂体柄都平衡好，从前到后纵向切开。心脏：一般安静地取出心房、瓣膜和心室。与正常组织一起，还可以单独取病变部位。另外还可以获得心室肌，乳突肌组织。肺：日常取材应包括左、右、两个肺叶(5个肺叶)，可以根据病变需要确定块数，在特殊情况下，记录下从哪些肺叶采集的材料可以标记成什么样。肾：应包括皮膜、皮层、水质和肾骨盆，并区分左右肾。胰腺：日常采集胰腺，如果矩形需要，添加胰腺和胰腺。肝脏：长方形或三角形可以用作胶片。脾脏：皮带皮膜。管器官：方向大，注意小肠：考虑到环状肌肉，沿长官的长轴采集(纵切)；食管：横切是适当的。上图：对胃底的日常提取；机构：横切、纵切。总之，棺材机构的各层结构都要去找。为了防止标本进入固定液后变形，去除切下的大小肠、胃等组织等材料后，在滤纸上铺上耳膜，放入固定液内，可以防止或减少组织的压缩变形和收缩。第二，固定组织，固定组织的意义：固定组织是制作切片的重要步骤之一，如果第一次固定失败，重新固定也不如一次固定，不能修复。处决动物后立即进行了采访，此时组织和细胞继续存活了一定的时间。迅速固定可以有效地防止组织和细胞在死后发生的一系列变化。固定的关键是尽量及时固定正在取用的资料，抑制死后的变化进度，使组织接近生前状态。另外，在制作标本的过程中，需要经过很多阶段，为了防止组织成分的溶解消失，需要及时将其转化为不溶性物质进行保存。固定组织的目的：。防止死后的变化，防止组织的自溶和腐败。以与生活时类似的形式保存蛋白质、脂肪、糖原、酶等组织的结构。染色容易，同时对组织起媒染作用，不同的组织成分对染料有不同的亲和力，使细胞各部分容易上色。能固化组织，为薄切片打下基础。组织固定注意事项：材料块不能太大；固定器皿不容易太小。固定液量约为固定材料体积的20 40倍，因此太少不容易。根据检查目的选择不同的固定液。例如，如果进行党员检查，就不能使用水性固定液，如果进行电子显微镜检查，就要使用锇酸固定液等。固定液：用于固定组织的药剂。固定金额分为两类。简单固定液：仅由一种药剂组成。混合固定液(或复合固定液):由两种或多种药剂组成的固定液。固定液选择标准：渗透性强，固定均匀，迅速渗入组织内部，使组织细胞结构在生活期间保持相似状态。不使组织过度收缩和膨胀变形。组织的蛋白质、糖、脂肪等可以迅速凝固，成为不溶性物质。使组织达到一定的硬度，便于制作切片和染色。价格低廉，购买容易，准备容易。常用简易固定液乙醇(醇)乙醇甲醛(福尔马林) (缓冲液制备)福尔马林中铬酸钾泊他施比酸钾氨基甲酸奥司米卡酮醋酸冰醋酸格莱乙醇(酒精)醇是不能与氧化剂混合的还原剂。固定酒精的最佳浓度为70%到80%，酒精浓度越高，组织收缩越严重。相反，浓度太低，没有固定效果。酒精能沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，后者的沉淀物容易溶于水，因此酒精固定的标本核不易染色。酒精也溶解脂肪、血红蛋白和各种色素。因此，脂肪染色应使用冷冻切片。，乙醇的优点：易于使用，经济，国内市场95%的乙醇和绝对(100%)的乙醇；能使组织硬化并起到固定作用。也是最常用的脱水剂缺点之一。穿孔力小，由于表面硬化，固定液不容易渗入组织，因此用乙醇固定的组织材料很小。组织收缩严重。染色效果一般。2 .甲醛(福尔马林)福尔马林是不能与氧化剂混合使用的还原剂。它是可用于组织学、酶组织化学、免疫组织化学等染色的最常用固定液之一，到时候最合适。目前，甲醛被认为是致癌剂、致畸剂等。甲醛溶液是无色透明易挥发，刺激性气味强的液体。商业甲醛是37%到40%的甲醛水溶液，即福尔马林。一般固定配方的浓度为4%到8%，习惯性地称为10%或20%的福尔马林。这种液体可以在室温下固定24 48小时，具体取决于前面提到的提取大小。如果需要快速固定，可以加热到70 80 或煮10分钟以满足固定要求。这些快速固定组织块不应太厚或太大。缺点是组织收缩更严重。添加法：商品的1份甲醛和9份自来水(最好用PBS等缓冲液)混合，会成为甲醛固定液4%的浓度。优点：渗透力强。组织收缩小。核染效果好。缺点：一般来说，质量不好的福尔马林在低温下长期保存，容易产生称为三重甲醛的白色沉淀物。后者氧化后会变成甲酸，使溶液呈酸性，影响细胞核的碱性染色。修正方法：碳酸钙或碳酸镁可在适量的备用甲醛溶液中加入适量的大理石或白色粉笔作为中和剂。另外，用酸性福尔马林固定的组织产生了很多褐色或黑色素，即福尔马林色素，这种色素不溶于水，不溶于酒精，影响染色效果和切片观察的小黑色颗粒，在那片中发现。去除福尔马林色素颗粒的方法：舒利德法25%氨lml75%酒精200ml切片脱蜡后通过70%酒精时，在水中浸泡30分钟或更长时间后染色。Verocay法l%氢氧化钾lml70%酒精100ml切片除蜡后80%酒精10分钟，水用70%酒精。3 .锇酸(四氧化锇，osmicacid)是一种金属氧化物，不是酸性，水溶液是中性反应，结晶为淡黄色，价格昂贵，仅适用于特殊染色，例如在制作电子显微镜超薄切片之前固定小组织块。锇酸是强氧化剂，不能与酒精和甲醛混用。锇酸挥发性很强，对气味有很强的刺激性和固定作用，使用时要非常小心，并且要有保护措施。特征：固定的组织必须小而薄，组织的固定可以和生活期间相似，这是主要优点。锇酸是用于脂肪和地质的优秀固定剂，对显示线粒体和内质网等小器官有很好的效果。准备：电子显微镜超薄切片的小组织块后，固定用锇酸浓度为1%。0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.27.410ml 2%四氧化锇水溶液10ml。4 .丙酮丙酮可以沉淀蛋白质，渗透力强，但对组织的收缩严重；对原子核的固定不好。目前组织化学，尤其是酶的保存，常用冷丙酮固定法，主要用于磷酸水解酶及氧化酶的固定，也用于混合固定液。5 .聚甲醛缓冲固定液paraformaldehyde聚甲醛4g，0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.2100ml加热60 80 溶解。固定15min 24h，0 4。主要用于科学研究组织的标本固定，特别是用于免疫组织化学染色的组织固定，保护抗原决定基不关闭。6.添加戊二醛磷酸缓冲液glutaricdialdhyde 25%戊二醛10ml，0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.27.490ml。固定时间为60分钟，0 4 。主要用于科学研究组织标本的固定，尤其是电子显微镜下超薄切片小组织块标本的初始固定。一般混合固定液：种类很多。根据检查目的，可以选择不同的固定液。1.Zenker固定液：重铬酸钾2.5g汞增加(HgCl2)5g蒸馏水100ml冰醋酸(临时添加)5ml，准备方法：先混合重铬酸钾、汞增加和蒸馏水，然后加热溶解，冷却后过滤，放入棕色玻璃瓶中，保存红光。这种配制液体一般称为Zenker干溶液(保管液，底液)。这比较稳定，制造一两年后也有固定效果。在采访组织时，在第n克干液100毫升中加入5毫升冰醋酸即可使用，但在添加冰醋酸后应立即使用，否则没有固定效果。特征：细胞核和细胞质染色均明显稳定，对肌组织和结缔组织染色良好。材料厚度为2mm固定3 4小时以下，通常固定为12 24小时。但是要用12 24小时流动的水冲洗后，用酒精脱水。2 .carnoy固定液纯酒精(或95%)氯仿3冰乙酸1优点6个：这种液体快速渗透，小组织l 2小时。这种固定液固定细胞质和糖原。冰醋酸对染色质有固定作用，同时抵消酒精引起的过度收缩和硬化。为了减少组织的收缩，可以使用冷卡诺尼。Carnoy液体最好将12 18小时以下的冰箱与组织固定在一起。用这种液体固定的组织可以用95%或100%酒精脱水，最好是目前使用的。也可用于一般组织学固定，组织化学可以使用很多固定剂。特别是用于糖原，DNA，RNA固定。组织固定方法，1 .in situ固定法在动物活体情况下利用快速边缘水滴和固定液去除标本后浸泡30分钟-1h，有利于组织结构的保存。上述工作应在0-4 进行。2.用烟丝固定法提前冷藏固定液应为0-4 ，固定液应至少为样品的40倍，浸泡30-90分钟以上，取决于组织和固定液。3.培养细胞和涂片固定法单层细胞培养病只需将培养内膜渗透固定即可。悬浮培养细胞需要在离心浓缩后涂上涂层，或在离心管中放入固定液2000r/min左右20min离心力块，制成切片。也可以向离心管添加果冻和离心力，切断离心管末端果冻固定。4.灌注固定法通过心血管途径向全身或器官注入固定剂，将活细胞迅速固定到位后采集，可以达到很好的固定效果。尤其对大脑等需要长时间采访的器官更有意义。麻醉或使动物颈椎脱位处死后，立即打开胸腹和心包，注射唾液，扎入左心室或主动脉，切下右耳穴，立即用含有适当量肝素的生理盐水或缓冲液灌注冲洗血液；然后快速用固定液继续灌注，灌注量和灌注压应根据灌注血管确定。大老鼠心脏灌注时的压力约为100-150mmHg，灌注量约为5-10ml/min，灌注时间一般为5-20min，首先观察动物肝脏纹理硬化。灌注固定完成后(也可以继续用缓冲液注入清除固定剂)，可以在固定液后固定2小时。灌注固定快速均匀，保存细胞组织的超微结构，但只有掌握操作技术才能达到固定目的。第三，水洗，水洗水道水，代替组织块固定溶液，水洗必须足够。水洗时间数小时到24小时。根据材质的数量和大小，灵活地掌握水洗工具，用水洗筐或纱布包裹后，防止手工将军组织的结块脱落或丢失。科研用小材料也可以用PBS溶液浸泡多次洗涤，但要保证至少4-6小时的洗涤时间。4、脱水、组织块确定后变硬，但不能达到薄片的硬度，必须进行固定液以外的处理。脱水是继固定之后的重要阶段。固定和洗涤后，组织中含有大量水分，在这种情况下，必须先从组织内去除水分。这种除水分的过程称为脱水，用于脱水的药剂称为脱水剂。脱水必须逐渐从低浓度酒精延伸到高浓度酒精。否则，组织会强烈收缩，易碎，因此制作不利，但脱水不彻底，难以浸泡蜡。，常用脱水剂：酒精、丙酮、正丁醇等。1.酒是从70%酒精到80%-90%-95%-100% I 1 100II%，每个阶段的脱