利用高通量测序技术发现植物小分子rna 研究进展VIP

中国农业科学2009，42(11):3755-3764中国农业科学杂志编号： 10.3864/期刊编号：0578-1752.2009.11.001接收日期：2009年1月16日；验收日期：2009-03-04基金项目：国家“863”计划小麦抗病性状功能基因组计划(2006AA10A104)，中央公益性研究所基础研究经费专项(2060302-10)。作者简介：韦伯(1981-)，男，山西阳城人，博士，研究方向：植物小分子核糖核酸克隆。电话电子邮件： weibo_009。cn .通讯员毛龙(1965-)，男，浙江宁波人，研究员，研究方向为功能基因组学和生物信息学。电话：摘要：小分子核糖核酸是一类长度约20 30个核苷酸的非编码核糖核酸分子，其介导的转录后基因调控是植物中一种新型的基因调控机制。它在植物生长和适应各种环境胁迫的过程中起着非常重要的作用。植物中小子核糖核酸的数量和种类巨大，高通量测序技术的出现大大加快了它们的发现过程。在简要介绍目前已知的植物小分子核糖核酸的类型和特点的基础上，全面阐述了近年来利用高通量测序技术克隆和分析植物小分子核糖核酸的研究成果，以反映植物小分子核糖核酸基因组分布、功能和进化的最新研究进展。关键词：高通量测序技术；454-FLX；Solexa小分子核糖核酸；Microrna小干扰核糖核酸在植物小核糖核酸研究中的进展通过高通量测序微博，张荣志，-李，毛龙(中国农业科学院作物科学研究所/作物基因资源和遗传改良国家重点设施，北京100081)摘要：小核糖核酸是20-30个核苷酸长的非编码核糖核酸。小RNA介导的转录后调控代表了一种新的基因调控机制，在植物生长发育以及对不同环境胁迫的响应中发挥着重要作用。在植物中，有大量不同类型的小核糖核酸。高通量测序技术的进步极大地促进了他们的发现。在这篇综述中，除了简要介绍小核糖核酸的特征外，作者还试图总结利用下一代测序技术进行小核糖核酸研究的最新进展，并旨在突出植物基因组组织、功能和进化方面的新发现。关键词：高通量测序；454-FLX；Solexa小核糖核酸；microRNA小核糖核酸(小核糖核酸)是一类具有20 30个核苷酸的非编码核糖核酸分子。自从它于1993年在1-2中首次被发现以来，人们越来越意识到小分子核糖核酸3-6的重要用途。与大量小分子RNA相比，传统的桑格测序方法操作复杂、昂贵、测序深度有限、效率低下，极大地限制了植物小分子RNA的发现速度。自2005年以来，人们开始使用以大规模并行签名测序(MPSS)7)、454-FLX(454生命科学)8和索莱沙(伊明娜)9为代表的新焦磷酸测序技术来发现植物小分子核糖核酸。尽管这些第二代测序技术获得的序列相对较短，但它们具有速度快、成本低、覆盖面广和产量大的优点。因此，它们通常不适合于小分子核糖核酸的测序，特别是那些拷贝数低的。以微小核糖核酸为例，互补链的出现已成为判断其是否为微小核糖核酸基因10-11的必要和充分条件。然而，miRNA互补链在miRNA形成后进入降解途径，因此拷贝数极低，无法通过传统测序技术检测。因此，高通量测序技术可以极大地促进植物小分子核糖核酸基因的发现过程，为研究小分子核糖核酸的合成机制和生物学功能以及3756中国农业科学在物种间的进化规律提供大量信息。由于小分子核糖核酸在植物的生长、发育和对外来胁迫的反应中起着重要作用，12-23，已有许多关于其生物合成和功能研究的评论24-27。因此，本文在简要介绍各种植物小分子核糖核酸特点的基础上，重点总结了近年来利用高通量测序技术开发植物小分子核糖核酸的研究成果，以反映高通量测序技术在加速植物小分子核糖核酸发现、促进植物小分子核糖核酸功能研究和提高人们对植物小分子核糖核酸进化认识方面的最新进展。1植物小分子核糖核酸及其生物合成根据植物小分子核糖核酸生物合成途径的不同，大致可分为两大类：微核糖核酸(miRNA)核糖核酸(小干扰核糖核酸(siRNA)。其中，siRNA分为siRNA(天然反义siRNA (nat-siRNA(反式siRNA (ta-siRNA)和异染色质小核糖核酸28-30)。植物小分子核糖核酸的生物合成需要多种蛋白质和酶的参与。在拟南芥中，第三型核糖核酸酶(二聚体样，DCL)、核糖核酸依赖的核糖核酸聚合酶(核糖核酸依赖的核糖核酸聚合酶，RDRP)和阿尔戈纳特蛋白(AGO)都是小分子核糖核酸生物合成途径31-32的重要成员。1.1 miRNA miRNA:发现的第一种内源性单链小分子RNA，具有重要功能，长度为20 23个核苷酸。在每一种植物中都有数百个编码miRNA的基因(不同物种的体细胞数量不同)33，这些基因在不同的细胞和植物发育的不同阶段表达28。MiRNA基因被转录形成miRNA转录物(pri-miRNA)，然后miRNA前体(miRNA前体或PRE-miRNA)在HYL 1(HYPONIC LEAVES 1)、DCL1和SE(serrate) 34-36的相互作用下形成。前miRNA可以形成具有茎环特征的二级结构。MiRNA位于茎环的茎上。通常，前miRNA被DCL1切割形成miRNA/miRNA*寡核苷酸二聚体。这些二聚体被甲基转移酶HEN1甲基化到它们的3末端碱基，成为成熟的miRNA15，37。然后将成熟的单链miRNA组装成含有前白蛋白38的RISC(核糖核酸诱导沉默复合物)。然而，miRNA*是逐渐退化的39。MiRNA通过切割靶基因转录物或抑制其翻译3，40在RISC指导下执行基因沉默功能。1.2 siRNAsiRNA种小分子核糖核酸由长双链核糖核酸产生。SiRNA可以在基因组的许多位点产生。在植物中，内源siRNA可以直接来源于转录物、转基因的反向重复序列、转座子等。到目前为止，三种siRNA的生物合成已经比较清楚了28。第一种类型被称为nat-siRNA，它是由在同一基因群位点部分重叠的双向转录物产生的。它的生物合成需要RDR6和一个或两个DCL蛋白的参与。目前，研究最清楚的两个nat-siRNA分别是在生物胁迫和非生物胁迫下产生的，它们的功能是通过下调nat-siRNA产生41-42中涉及的两个基因之一的表达来实现的。第二种类型的siRNA被称为塔-siRNA，是一种跨行为的内生siRNA。由ta-siRNA调控的靶基因序列和产生ta-siRNA的序列分别位于基因组43的不同位点。在拟南芥中，TAS(ta-siRNA)家族(ta S1 4)的四个基因本身都是miRNA靶基因。它们的转录本在特定位点被相应的miRISC剪切。切割的片段被SGS3稳定后，在RDR6的作用下合成dsRNA44-45。然后DCL4将dsRNA切割成21个核苷酸长的ta-siRNA46-48，最后ta-siRNA在AGO1或AGO 738，49-50的参与下完成其功能。报道的ta-siRNA靶基因包括生长素响应因子ARF3(生长素响应因子3)和ARF446，49，51。第三种类型的siRNA是hcRNA，其大部分由转座子、反转记录元件和从基因组中的重复序列转录的dsRNA前体产生，并且倾向于分布在通过甲基化修饰的基因组区域中25，52-53。在生物合成中，dsRNA首先在RDR2的作用下形成，然后DCL3切割dsRNA，HEN1甲基化切割产物，最终形成长度为24 nt的成熟siRNA，然后siRNA与AGO4或AGO6结合形成AGO-siRNA复合物。在D1博士(核糖核酸导向的脱氧核糖核酸甲基化缺陷1)和聚合酶b(聚合酶b)的合作下，H3组第9位胞嘧啶(C)或赖氨酸的甲基化通过甲基转移酶DRM 2(结构域重排的甲基转移)31，54-59在相应的基因组位点上进行。其它类型的小分子核糖核酸，如长度为25-31 nt的piwi相互作用核糖核酸(PIWI相互作用核糖核酸)，因其与哺乳动物PIWI蛋白的相互作用而命名，在植物31，60-64中未见报道。植物小分子核糖核酸在基因组中的分布和染色质修饰利用高通量测序技术研究植物小分子核糖核酸的最早发现是小分子核糖核酸的大量和多样性。韦伯等。第11期：高通量测序技术3757发现的植物小分子核糖核酸的研究进展起初，人们认为这些非miRNA小分子核糖核酸可能来自靶基因的随机片段。然而，大量siRNA病毒的反复出现及其在基因组上的广泛而规则的分布逐渐使人们认识到它们可能是由细胞中的特定机制产生的。目前已知植物小分子核糖核酸直接参与染色体修饰和基因表达调控。2005年，迈耶斯实验室首次使用大规模平行测序技术(MPSS)对4个拟南芥小分子核糖核酸文库进行测序。在分析了2.21106个长度为7 11 nt的序列标签后，令人惊讶地发现超过1/2的拟南芥小分子核糖核酸来自基因组的重复序列或基因之间的非编码序列，特别是那些最初被认为没有转录特征的区域实际上产生了大量的小分子核糖核酸53。这一结果只是解释了以前研究中观察到的现象，即染色体和siRNA上富含转座子的异染色质区域的甲基化和乙酰化经常同时发生在65-66，表明植物染色体的DNA甲基化或组蛋白乙酰化修饰依赖于小分子核糖核酸的介导。Sunkar等人22还系统地分析了拟南芥基因组上siRNA产生位点的甲基化和乙酰化，发现大多数s