原位杂交流程

原位杂交流程卢朝晖 整理 以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针，对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有，但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的，因此特加以综合供同行参考，在具体操作过程中很多地方可酌情变更。 在临床应用中，常常可以买到已经标记好的商品探针，那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去，从石蜡切片处理做起即可。 下面介绍的方法笔者已亲手做过数次，可获满意结果。 主要操作步骤： 制备感受态细菌 用含目的基因的质粒转化细菌 小量培养转化的细菌 小量提取质粒 小量酶切质粒 电泳鉴定 大量培养转化的细菌 大量提取质粒 大量酶切质粒 电泳分离、回收及纯化 标记探针 石蜡切片的处理 预杂交、杂交 杂交后处理 抗体连接、显色 制备感受态细菌 【试剂及配制】 1LB液体培养基 在900ml三蒸水中加入： 胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(bacto-extract) 5g NaCl 10g 磁力搅拌使完全溶解，用5mol NaOH调节pH至7.0（如用进口试剂则不必调）。定容为1000ml，高压灭菌20min。 20.1mol CaCl2溶液： 1.1g无水氯化钙，溶于90ml三蒸水中，定容至100ml，用0.22m滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中，4保存。 【材料】 大肠杆菌单菌落或冻存菌种，也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。 【操作方法】 1从37培养1216h的平板中用无菌的接种环（用前酒精灯烧红晾凉）挑一单菌落，转入含有5ml LB培养基的无菌试管，37振摇 （200r/min）过夜。次日取菌液1ml加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶，37振摇培养（200300r/min）约23h，将烧瓶取出立即置冰浴1015min； 2以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心管中； 34离心，5000g 10min，回收细菌； 4弃去培养液，将管倒置于滤纸上1min，流尽培养液； 5用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体，置冰浴30min； 64离心，5000g 10min，弃上清，倒置于滤纸上1min； 7加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 ，重悬菌体，动作要轻； 8置4冰箱1224h，即可用于转化。 感受态细菌的冻存 一次制备的感受态不能用完，可冻存起来备用。将甘油装1.5ml EP 管中，沸水浴10min以杀菌。将感受态细菌分装成400m一份，每份加30%体积的甘油，充分混匀，置-70冰箱，一年内可使用。 用含目的基因的质粒转化细菌 【试剂及配制】 1LB液体培养基 2氨苄青霉素（Amp）选择性培养基 LB培养基中加入1.5%的琼脂（15g/L），高压灭菌20min，取出，在无菌条件下，冷却至50左右时（烧手但尚可忍受）加入抗生素或其他必需成分，如为氨苄青霉素（Amp）选择性培养基，则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50g/ml的量加入，即每ml培养基加入1l氨基苄。 3氨苄贮存液 将氨苄青霉素钠溶于三蒸水，配成50mg/ml溶液，以0.22m滤纸过滤，1ml一份分装，存于-20。 【操作方法】 1无菌状态下取新鲜感受态200l置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的感受态细菌时，将其从-70冰箱取出，握于手中，待其解冻后立即吸取200l 转移至10ml无菌玻璃试管中，剩余的感受态弃去，不能再冻存复用； 2每管加质粒50100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min； 342 水浴热休克90s，不要摇动试管； 4每管加无抗生素的LB培养基1ml，37摇床温和摇振（100150r/min）45min； 5用无菌的弯头玻璃铺菌器（用前酒精灯烧，再晾凉）将200l菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37放置20min，然后倒置培养1420h（37）。 小量培养转化的细菌 【操作方法】 1取灭菌处理的10ml 玻璃试管，用无菌吸管加入约5ml LB液体培养基，再加入50mg/ml 氨苄青霉素5l； 2用接种环或无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，晃动使细菌进入培养液，封好管口； 337摇床100200r/min，约612h，可过夜，使生长饱和。 质粒的少量提取 【试剂及配制】 1溶液 葡萄糖（C6H12O6H2O） 1.982g 三蒸水 160ml 0.5mol EDTA pH8.0 4ml 1mol Tris-Cl pH8.0 5ml 以三蒸水定容至200ml，高压灭菌，4保存 0.5 mol EDTA pH8.0 的配制： Na2EDTAH2O 186.1g （如无水，则为175g） 三蒸水 700ml 边磁力搅拌边加入固体NaOH，缓慢少量加入，待充分溶解，pH接近8.0，用酸度计调节pH8.0 （HCl/NaOH）； 1mol Tris-Cl pH8.0 的配制： Tris 碱 121g 三蒸水 800ml 充分搅拌，用浓盐酸将pH调节至8.0，酸度计测量； 2溶液 配制50ml的量，现用现配。 10 mol NaOH 1ml 三蒸水 40ml 10% SDS 5ml 用三蒸水定容至50ml 10mol NaOH 的配制： 40g NaOH晶体加三蒸水至100ml； 10% SDS 的配制： 戴口罩，称10g SDS，溶于80ml三蒸水中，68助溶，加数滴1mol HCl，调pH7.2，定容至100ml； 1mol HCl 的配制： 于通风橱中，三蒸水91.4ml，浓盐酸8.6ml，混匀； 3溶液 5mol 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 三蒸水 28.5ml 高压灭菌，4保存； 5mol 乙酸钾配制：200ml 乙酸钾 98.14g 三蒸水 160ml 搅拌溶解，定容至200ml; 43ml 乙酸钠（NaAc）pH5.2 配制：500ml 乙酸钠（CH3COONaH2O） 201.1g 三蒸水 200ml 用冰乙酸调节pH为5.2，三蒸水定容至500ml，高压灭菌，4保存。 5平衡酚 在粗酚中加入0.1% 8-巯基喹啉，然后倒入0.1mol Tris-Cl pH8.0，避光磁力搅拌4h，静置后移去水相，再加0.1mol Tris-Cl pH8.0，搅拌、去除水相，反复进行，直到水相pH7.8时为止，装棕色瓶，4保存。 6TE 缓冲液 pH8.0 配制最终使：10mmol Tris-Cl pH8.0 1mmol EDTA pH8.0 7其它试剂：氯仿：乙戊醇（V/V=24：1）、无水乙醇、70%乙醇 【操作方法】 1取1ml菌液置于1.5ml的EP管中，10000g30s 离心； 2控尽上清液； 3加溶液 100l，重悬菌体； 4加溶液 200l ，倒转均匀； 5加溶液 150l ，混匀； 610000g5min 离心； 7转移上清至另一EP管； 8加等体积平衡酚混匀，室温离心，8000g5min； 9小心吸取上清，转移至另一EP管中，勿将酚层吸出； 10重复8、9的步骤； 11等体积氯仿：乙戊醇，混匀； 12离心，8000g5min； 13转移上清至另一EP管； 14加1/10体积3mol NaAc pH5.2 和2.5倍体积的无水乙醇，混匀； 15置液氮10min 或-20冰箱1h； 16离心，10000g10min； 17弃上清，留沉淀，70%乙醇洗一次； 18离心，10000g10min； 19弃上清，留沉淀，晾干； 20加TE pH8.0 50l ，溶解沉淀； 21加RNase A (10mg/ml) 35l 混匀，稍离心； 2237 水浴30 min； 23-20 保存待用。 小量酶切质粒 鉴定常用20l反应体系。 【操作方法】 1在灭菌的新EP管中加入7l三蒸水； 2加入10缓冲液2l ； 3加限制酶5l ； 4最后加入质粒DNA10l ； 5稍离心，混匀； 637水浴11.5h； 7无水乙醇沉淀（2.5倍体积无水乙醇，混匀液氮10min或-20 30min，离心）； 8弃上清，晾干，加10l TE，建立第二个酶切体系，37 11.5h； 电泳鉴定 【试剂及配制】 10.5 TBE 先配5 TBE贮存液，然后用三蒸水稀释10倍； 5 TBE配制：1000ml Tris 碱 54g 硼酸 27.5g 0.5mol EDTA pH8.0 2ml 2EB ：10mg/ml 3琼脂糖 4上样缓冲液 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 30%甘油 【操作方法】 1用胶带纸封住洗净、晾干的电泳胶盒两端，放好梳齿，水平放置于工作台上； 20.5 TBE + 琼脂糖 （1%），电炉上融化，勿暴沸，待其冷却至5060 时，加入EB约5l ，充分混匀； 3将凝胶倒入胶模，厚约35mm，避免产生气泡； 4在室温中放置3045min，撕去胶带纸，放入电泳槽，电泳槽内为0.5 TBE，应没过凝胶，去除梳齿，预电泳10min； 5将DNA样品与上样缓冲液混合，加进上样孔内，应设一marker作对照； 660100V恒压电泳，使DNA向阳极移动（黑线为负极，红线为正极）； 7电泳完成后，戴塑料手套，取出胶盒，将凝胶放紫外灯下观察有无切出的电泳带。 大量培养转化的细菌 小量酶切鉴定证实细菌内含有目的基因，即可大量培养。 【操作方法】 在500ml灭菌处理过的培养瓶中加LB培养基200ml，加入50mg/ml的氨苄贮存液200l ，将小量培养的菌液取2ml加入瓶中，37 200300r/min，振摇培养610h，可过夜。 大量提取质粒 常用碱裂解法。 【试剂及配制】 1.溶液 2.溶液 3.溶液 4.异丙醇 5.3mol NaAc pH5.2 6.平衡酚 pH8.0 7.氯仿：乙戊醇 （24：1） 8.无水乙醇 9.70%乙醇 10.TE pH8.0 11.RNase A (10mg/ml) 12.溶菌酶 取100mg 溶菌酶，用2ml三蒸水溶解，分装成200l /管，贮存于-20 备用 【操作方法】 1扩增好的菌液装入50ml离心管中，置冰浴10min； 24离心，5000 10 min； 3将沉底的细菌收集到一只50ml离心管中，再离心，弃上清，将离心管倒置滤纸上1 min，控干残液； 4加入6ml冰预冷的溶液 ，200l 溶菌酶，充分振摇混匀； 5加溶液10ml，缓慢振摇以充分混匀内容物，室温放置10min； 6加入8ml冰预冷的溶液 ，小心摇动离心管以混匀内容物，置冰酒精浴10min； 74离心，10000g 10min； 8小心倒出上清，弃沉淀，如有沉淀，再次离心； 9加入0.6体积异丙醇，充分混匀，-20 放置20min； 104离心，10000g 10min； 11弃上清，晾干，2ml TE pH8.0 溶解沉淀； 12加入2ml冰预冷的5mol LiCl 溶液并混匀； 134离心，10000g 10min； 14将上清转移至另一离心管，加入0.6体积异丙醇，充分混匀，-20 放置20min； 154离心，10000g 10min； 16弃上清，70%乙醇洗一次，4离心，10000g 10min，弃上清，晾干； 17将沉淀溶于1.2ml TE pH8.0中； 18加RNase A 30l ，封管口，37 水浴30min； 19将样品分装2个EP管，各加等体积平衡酚，混合； 20室温离心，5000g 5min； 21将上层水相转移至另一EP管，小心勿吸出酚相； 22重复平衡酚抽提； 23等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提； 24室温离心，5000g 5min； 25回收上层水相，勿吸出氯仿； 26加1/10体积3mol NaAC (pH5.2)，再加2.5体积无水乙醇，充分混匀，置-20 30min或液氮10min； 27室温离心，12000g 15min； 28弃上清，70%乙醇洗一次，再离心； 29晾干，溶于500l TE pH8.0，-20 保存； 30取2 l 稀释至200l ，用紫外分光光度计测260nm、280nm OD值，OD260/OD280=1.72.0，如小于1.7，蛋白未提净，大于2.0，有机溶剂多。DNA含量为OD260 50 （g /ml）。 大量酶切质粒 【操作方法】 1在新的灭菌EP管中依次加入： 三蒸水 70l 10 缓冲液 10l 限制酶 5l 质粒DNA（2g /l） 15l 稍离心以混匀； 237 水浴1.52h； 3取5l 电泳鉴定酶解效果，如不完全，可延长时间或加限制酶； 4双酶解反应：如两种酶可用同一缓冲液，则可同时加入一个体系，稍增加反应体积，否则以乙醇沉淀，晾干，重建第二个反应体系。 电泳分离、回收及纯化DNA片段 电泳的方法如前述，不同点在于： 使用低熔点琼脂糖，在4 冰箱中电泳； 将23个梳齿用透明胶布粘在一起，以增加上样量。 从低熔点琼脂糖中回收及纯化DNA： 【操作方法】 1在紫外灯下将含有所需DNA片段的凝胶条切下，放入EP管中，加入2倍体积的TE缓冲液，在70 保温10min，使凝胶条融化； 2冷却至室温，加等体积平衡酚，充分混匀后以6000g离心10min，回收水相，注意不要将界面处的白色物质（即粉状的琼脂糖）吸出，再用等体积的氯仿/乙戊醇抽提一次； 3将上清液转移到一个新的离心管中，加入0.2体积的10mol的乙酸胺和2倍体积的无水乙醇，置-20 冰箱20min，离心沉淀核酸，晾干后以TE 溶解。取2l 稀释至200l测DNA浓度。 标记探针 使用Boehringer Mannheim 地高辛标记探针试剂盒。 【操作方法】 11l 模板DNA加灭菌三蒸水至最终体积为16l； 210min沸水浴，立即冰乙醇冷轧； 3加入4l 探针标记液（试剂盒中vial 1），稍微离心，混匀； 437 水浴20h； 5加入2l 0.2mol EDTA pH8.0 或加热65 10min以终止反应。 石蜡切片的处理 【试剂及配制】 1二甲苯 2乙醇（100%，95%，90%，75%） 3甲醇 40.2mol HCl 50.1% Triton X-100 60.2%甘氨酸PBS 75mmol MgCl2-PBS 8PBS 配制：配成10 的贮存液，用时稀释10倍 NaCl 80g 137mmol KCl 2g 2.7mmol Na2HPO47H2O 11.5g 4.3mmol KH2PO4 2g 1.4mmol 配成1000ml，pH7.3，高压灭菌。 9蛋白酶K 0.1mol Tris-Cl pH8.0 加 50mmol EDTA pH8.0 配制浓度为1g/ml。 104%多聚甲醛 在通风橱中配制：称40g多聚甲醛溶于装有500ml DEPC 水的烧瓶中，加热65 并磁力搅拌，使成乳白色悬液，用1mol NaOH 调节 pH7.0，呈清亮状，再加入约450ml 的2 PBS，充分混匀，再检查pH，过滤后定容至1000ml，4 保存。 【操作方法】 1将烤好的切片入二甲苯 30min，二甲苯 、 各10min； 2逐级酒精入水（100%、95%、90%、75%）各5min，甲醇冲洗5min 2； 3用三蒸水或PBS快速洗2次； 40.2mol HCl 室温作用10min， 0.1% Triton X-100 作用15min； 50.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min； 6蛋白酶K37 消化1530min； 70.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min； 8PBS-5mmol MgCl2洗2次，各10min； 94%多聚甲醛室温下固定15min； 10PBS-5mmol MgCl2洗2次，各10min； 11逐级酒精脱水，37烤干保存。 预杂交、杂交 【试剂及配制】 12 SSC 先配制20 SSC贮存液，用时稀释。 NaCl 175g 3mol 枸椽酸三钠2H2O 88g 0.3mol 三蒸水加至1000ml，用1mol HCl 调pH7.0 24 SSC/50%去离子甲酰胺（V/V） 去离子甲酰胺的配制：500ml 甲酰胺与25g Bio-Rad AG 501-X8(2050目) 混合，室温避光搅拌4h，过滤，分装为50ml ，-20 存放； 3100 Denhardt液 聚蔗糖 10g 聚乙烯吡咯烷酮 10g 牛血清白蛋白 10g 消毒三蒸水定容至100ml 4预杂交液 去离子甲酰胺 5ml 20 SSC 2.5ml 加温至50 ，加入硫酸葡聚糖 1g 聚合物溶解后，加入100 Denhardt 500l 10%SDS 500l 10mg/ml变性鲱鱼精子DNA 100l 消毒三蒸水 400l 充分混合； 5杂交液 将标记好的探针用沸水浴10min，立即冰酒精冷轧，用预杂交液将探针稀释至0.55ng/l 。 【操作方法】 1用2 SSC 简洗15min； 24 SSC/50%去离子甲酰胺37 孵育15min； 3每片加预杂交液50l ，放入湿盒，42 孵育2h； 4去除预杂交液，每片加杂交液50l ，放湿盒中，42 杂交1218h，不能超过24h。 杂交后处理 【试剂及配制】 12 SSC 22 SSC/50%去离子甲酰胺 31 SSC/50%去离子甲酰胺 4PBS 54 SSC/10mmol DTT 先配制1mol DTT：通风橱中称3.1g DTT，溶于20ml消毒三蒸水中，用时取2ml 加入198ml 4 SSC 【