分子诊断技术

分子诊断技术,.,常见的核酸分子诊断技术,核酸分子杂交(NucleicacidmolecularHybridization)基因芯片（GeneChip）聚合酶链反应(polymerasechainreactionreaction；PCR),.,核酸分子杂交的原理,双链核酸加热或经硷处理变性后，可解链成两条互补的单链核酸。在适当温度、盐浓度下，双链能按硷基互补配对原则(A-T,C-G)复性而重新成为双链核酸。用已知序列的单链核酸，经标记制成核酸探针，与变性后的待测标本核酸进行杂交，通过检测标记探针的信号，可判断标本是否存在与探针互补杂交的同源核酸。,.,核酸分子杂交探针的制备,制备探针的靶核酸可通过:分离、切割病毒的特定核酸片段获得;用重组技术，将该片段克隆到细菌质粒，经扩增和纯化大量获得;选择已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸，其长度以20个左右最为常用，过短易出现非特异性杂交。,.,核酸分子杂交探针的制备,常见的用于标记探针的示踪物质放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，杂交后可通过放射自显影技术进行检测非放射性物质如：生物素、地高辛和酶等，杂交后可通过底物显色、化学发光等技术进行检测,.,核酸分子杂交示意图核酸分子杂交的程序,.,常用的核酸分子杂交技术,斑点杂交（spotblothybridization）凝胶电泳印迹转移杂交（Southernblothybridization)原位杂交（in-situhybridization）,.,斑点杂交,DotBoltHybridizationforHBVDNAQuantitationin5lofPatientSera,.,凝胶电泳印迹转移杂交原位杂交(Southernblothybridization)(in-situhybridization）,.,核酸分子杂交技术的应用,核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性等在医学上，目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检测等领域中。,.,基因芯片,基因芯片（或DNAChip,或Microarray）又称DNA微阵列，是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于500m）排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。,上图显示大量的DNA探针，按照一定的规律有序地排列在支撑物上，每个探针与相对应的特异互补序列结合后，即可发出荧光。利用该芯片可同时获取大量信息。,DNAMicroarray,.,基因芯片技术原理,大规模集成的固相杂交基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息,.,基因芯片的作用原理,.,基因芯片的制作方式,原位合成,直接点样,原位光蚀刻合成,原位喷印合成,分子印章法,针式点样,喷墨点样,光导原位合成法,.,基因芯片技术流程,.,基因芯片的应用,基因表达分析分析基因表达时空特征基因差异表达检测发现新基因大规模DNA测序基因型、基因突变和多态性分析疾病的诊断与治疗遗传病相关基因的定位肿瘤诊断感染性疾病的诊断耐药菌株和药敏检测,.,聚合酶链反应(polymerasechainreactionreaction；PCR),PCR是八十年代中期问世的一种体外模拟体内DNA复制过程的技术，可在短时间内将待测特异性DNA扩增百万倍以上，并具有简单、快速、特异的特点，成为分子生物学发展史的又一个里程碑。PCR不仅可检测各种DNA病毒的核酸，还可经过逆转录，检测各种RNA病毒的核酸，因而在各型肝炎病毒的检测中，敏感性远超过分子杂交，有着不可替代的作用。,.,PCR的常见类型,常规PCR逆转录PCR（RTPCR）巢式PCRnested-PCR原位PCR（in-situPCR）多重PCR,非对称PCR免疫PCR定量PCR随机引物PCR简并引物PCR锚定PCR,.,实时荧光定量PCR荧光检测技术,SYBRGreenI。是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。TaqMan水解探针。由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的特异核苷酸序列组成。,.,实时荧光定量PCR：水解探针法,退火延伸切割聚合完成,该法也称TaqMan技术，在PCR系统中，加入能和靶核酸模板杂交的探针，其5端带有荧光报告基团，发射的荧光被3端带有的荧光淬灭基团所吸收。引物延伸时，由于聚合酶具有的53核酸外切酶作用，可把荧光报告基团从探针上切下，因与淬灭基团远离，