病毒培养技术PPT课件

.病毒扩散技术，动物增殖病毒技术鸟类胚胎增殖病毒技术细胞增殖病毒技术，一是动物增殖病毒技术，选择动物的标准：大型动物应来自非疫区，最好是未接种相应病毒疫苗的青壮年和健康(经临床检查和检疫后)；(2)对相应的病毒敏感且非常敏感；(3)经隔离饲养和观察检查证明健康；兔、小鼠、大鼠等。应符合普通或清洁实验动物的标准；鸡应为非免疫鸡或SPF标准鸡；狗和猫应该有明确的品种，并符合普通实验动物的标准。体重和年龄应基本相同，个体差异不应太大。(1)家禽胚胎的选择SPF鸡胚根据国家标准，不含22种特定病原体的非免疫鸡胚应不含特定病原体的母体抗体。普通鸡胚可能携带鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产的异源疫苗：鸭胚胎和鸽胚胎，(2)家禽胚胎的接种途径和收获，绒毛尿囊膜接种，卵黄囊接种，羊膜腔接种，静脉接种，脑接种，鸡胚绒毛尿囊膜接种法，尿囊腔接种法，尿囊液收获法，鸡胚卵黄囊接种法，1。鸡蛋品质病原微生物：垂直传播，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、支原体和传染性贫血因子。(2)母体抗体，(3)抗生素：立克次体和鹦鹉热衣原体，(2)孵育技术，(1)温度：37 39.5。传染性支气管炎病毒37 (2)湿度：鸡胚53% 57%，水禽胚胎比鸡胚高5% 10%。通风：氧气和二氧化碳。(4)转蛋：(3)影响禽胚病毒增殖的因素，3.不同的接种技术对不同病毒的增殖有不同的接种途径，将同一病毒接种到不同年龄的禽胚上获得的病毒量也不同。接种年龄：鸡胚13-14日龄。15-16日龄鸭胚胎尿囊液含量最高，平均约6-8毫升，羊水约1-2毫升。接种部位：胚胎体和血管不应受到损伤，以免影响其发育，严格防止家禽胚胎污染鸡胚接种时严格无菌操作；(2)定期清洗消毒孵化室，保持室内空气新鲜；(3)孵蛋前，用温水清洗，消毒，晾干。细胞培养是指使用机械、酶或化学方法将动物组织或传代细胞分散到单个或甚至2-4个细胞团悬浮液中进行培养。细胞分类：根据细胞染色体和生殖特征，初级细胞(细胞株)细胞系，(1 1)原代细胞是指通过切割新鲜组织和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。(2)细胞株，也称为二倍体细胞，指具有特殊生物学特性和选自传代细胞的标记的细胞。这些细胞能保持原来的双染色体数目，并能连续传递许多代(50 100代)，但寿命有限。没有肿瘤起源。例如，PKl5、BHK21和Vero(3)连续细胞系)细胞系可以在体外无限期传代培养，并且便于应用。其染色体数目和增殖特征与恶性肿瘤细胞相似，且大多来源于癌细胞，如HeLa细胞系。固定培养，旋转瓶培养，悬浮培养，微载体培养，中空纤维细胞培养，微囊化细胞培养，2。细胞培养方法，悬浮培养，其中细胞总是通过振荡或旋转装置分散和悬浮在培养溶液中的培养方法，主要用于能够在振荡或搅拌下生长和繁殖的细胞，例如产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。微载体培养微载体的直径应为60 105 nm，无毒、透明，颗粒密度与培养液相似，略重于液体，可悬浮，不吸收培养液和化学反应，表面光滑，硬度和弹性小，易于细胞吸附在表面，如DEAE-葡聚糖凝胶A-50、细胞德克斯、细胞德克斯2、细胞德克斯3等。用于微载体培养的容器细胞产量达到106-107细胞/m1，每升培养液可添加2-5g微载体，每克8000-9000个珠子，培养面积约20-50000 cm2，比常规培养面积大10-25倍。中空纤维细胞培养：中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧装置和蠕动泵中空纤维由醋酸纤维、聚氯乙烯-丙烯复合材料或聚碳酸酯等材料制成，外径50-100米，壁厚25-75米，壁为海绵状，其上有许多微孔。中空纤维的内腔表面为半透性超滤膜，允许营养物质和代谢废物进出，对细胞和大分子物质(如单克隆抗体)有滞留作用。培养液能有效分布，细胞培养能维持数月，活性保持较高，培养细胞密度高，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度可达60%-90%；它占用空间小，适用于各种电池，但设备昂贵。培养液的血清细胞接种量、酸碱度、温度、无菌条件下培养容器的清洁度。细胞培养元素，RPMI-1640，199，DMEM，F12，血清成分：必需氨基酸，促进细胞生长和粘附的成分。-珠蛋白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白有毒性作用。糖蛋白、a2-球蛋白和-脂蛋白G2能促进细胞粘附。血清选择：同一个动物比不同动物的血清好；人血清和牛血清比马血清好。马血清优于兔血清和鸡血清。血清的使用：小牛血清是目前中国常用的血清。使用前，必须在56灭活30分钟，并进行细胞毒性试验。生长液的血清含量一般为5% 20%。保养液中的血清含量为0% 5%。血清替代因子：激素和生长因子(如胰岛素和上皮生长因子)、结合蛋白(如转铁蛋白)、粘附因子(如鱼精蛋白和多聚赖氨酸)和微量元素(如硒)是几十个四类。大多数无血清培养液必须补充3至8种血清替代因子。细胞接种量细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质。如果细胞数量太少，这些物质分泌较少，影响较小。接种细胞的数量越多，细胞生长成单层的速度越快，但是细胞太多不利于细胞生长。鸡胚成纤维细胞为100万/m1小鼠或仓鼠肾细胞为50万/m1猴肾细胞为30万/ml传代细胞为100-30万/m1(1)细菌污染(2)真菌污染：念珠菌或酵母。当在培养液中对黄色和白色小点悬浮物进行显微镜检查时，可以看到菌丝结构。(3)支原体污染：污染率为50% 60% (4)病毒污染组织污染培养液污染，4。细胞培养污染，(1)血清：保养液中小牛血清含量一般不超过2%。(2)温度：狂犬病病毒32，犬疱疹病毒36。(3)酸碱度：(4)病毒接种剂量：以TCID50为基准，一般注射1% 10%的维持液。接种量小，细胞不能完全感染，会影响毒性价格；如果接种量过大，将会产生大量非传染性缺陷病毒。(5)病毒接种方法：异步接种和同步接种。5。细胞培养病毒成分。6。病毒增殖指数和收获细胞病变效应：细胞收缩，如痘病毒和呼肠孤病毒；(2)细胞聚合，如腺病毒；(3)细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；微小病变，如正粘病毒、冠状病毒等。包涵体和血凝：它也可以用作检测病毒增殖的指标。有些病毒不产生氯化聚乙烯。病