β-地中海贫血基因检测(荧光PCR熔解曲线法20141013下午).ppt

-地中海贫血基因检测（荧光PCR熔解曲线法）,地中海贫血是指链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故常用荧光PCR熔解曲线法确定突变类型。我国各民族的地贫基因突变情况有一定差异，南方汉族的突变基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(AT)、IVS-654(CT)和TATAbox-28(AG)为主，占85%90%。,1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项2.掌握荧光PCR熔解曲线法原理及方法，熟悉其应用,【目的】,PCR技术，即聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是由美国PECetus公司的KaryMullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。,【原理】,PCR技术原理,该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端，并以此为起始点，沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,模板DNA(待扩增DNA)引物4种脱氧核苷酸(dNTPs)DNA聚合酶适宜的缓冲液,PCR反应的基本成分包括：,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的高温变性：93双链DNA解离成为单链模板DNA与引物的低温退火(复性)：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合引物的适温延伸：合成一条新的与模板DNA链互补链,每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,在连续加热使DNA变性的过程中以温度对DNA溶液的A260值作图，可得一条“S”形曲线，称为解链曲线（熔解曲线）。,解链曲线（熔解曲线）：,DNA解链曲线中吸光度值达到最大吸光度值的50%时的温度称为解链温度，也称为融解温度。此时DNA分子中50%的双链被解开。,解链温度（Tm）：,荧光PCR熔解曲线法原理,荧光PCR熔解曲线法原理,野生型与突变型DNA的碱基组成不同，因此他们的Tm值和熔解曲线不同，通过比较野生型与突变型DNA的Tm值和熔解曲线，并与标准Tm值对照，可以确定-基因突变型。,【操作步骤】,1.DNA获取（已准备好了）,2.PCR扩增：,反应液A管（做好记号）5000rpm，2秒加入5ulDNA溶液,总体积25微升,反应液B管（做好记号）5000rpm，2秒加入2.5ulDNA溶液,总体积25微升,PCR扩增条件,50，2min95，10min95，15s55，15