高效液相色谱法.ppt

高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC),第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节高效液相色谱法的类型及其应用,第一节概述,高压：150350105Pa高速：流动相流速可达110mLmin-1，1小时内可分离20种氨基酸；高效：气相色谱法柱效约为2000塔板/米；高效液相色谱法柱效可达3万塔板/米以上；高灵敏度：紫外检测器最小检测量10-9g；荧光检测器灵敏度10-11g，微升数量级进样。,高效液相色谱法的特点,HPLC与经典LC区别,经典LC：一种分离手段柱内径13cm,固定相粒径100m且不均匀；常压输送流动相;柱效低（H，n）；分析周期长;无法在线检测HPLC：分离和分析柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）；高压输送流动相;柱效高（H，n）；分析时间大大缩短;可以在线检测,气相色谱法与液相色谱法,分析对象：气相色谱只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物；在液相色谱中只要被分析的物质在流动相中有一定的溶解度即可。流动相作用：GC中只起运载作用；LC中与组分有一定亲和力，可通过改变流动相提高分离的选择性，且可选的流动相多。样品回收：LC可将样品很容易地回收，且可用来提纯和制备物质。GC将样品直接排空。灵敏度：LC不及GC。,第二节高效液相色谱法的类型及其应用,一、液液分配色谱法固定相,1、全多孔型担体：早期使用硅藻土、氧化硅、氧化铝等，与气相色谱法类似。填料不规则，出现“液坑”，使色谱峰变宽。20世纪70年代出现直径小于10m的硅胶作为固定相，柱效高。2、表面多孔型担体：是直径为3040m的实心玻璃微球上附着一层硅胶，厚度约12m。传质速度快，重现性好，但试样容量低。目前应用最广泛的为粒度510m的全多孔型微粒担体。,固定相担体示意图,3、化学键合固定相,利用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。种类：a.硅氧碳键型：SiOCb.硅氧硅碳键型：SiOSiC稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：SiCd.硅氮键型：SiN,SiOSiC键型反应,化学键合固定相特点,表面无液坑，比一般液体固定相传质快；无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；可键合不同官能团，能灵活地改变选择性；有利于梯度淋洗，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。广泛应用于正反相液液色谱法、离子交换色谱法及离子对色谱法。占液相色谱分析的70%80%。,正相和反相液液色谱法,流动相极性小于固定相极性为正相液液色谱法；反之为反相液液色谱法。反相键合相色谱应用最广泛。常以水为流动相。,二、液固吸附色谱法固定相,吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，仍可分为全多孔型和薄壳型两种。常用的是510m的硅胶微粒（全多孔型）。,三、离子交换色谱法固定相,基质有三类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。薄壳型离子交换树脂：以薄壳玻璃微球为担体，表面涂约1%的离子交换树脂而成。离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换树脂基团键合到惰性担体表面。表面多孔型离子交换树脂：在固体惰性核上覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。多孔型离子交换树脂：主要是聚苯乙烯和二乙烯基的交联化合物，有大孔和微孔之分。,四、空间排阻色谱固定相,固定相的填充物可以使用凝胶，也可以使用刚性的硅酸和多孔玻璃。凝胶是含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。软质凝胶：适用于水为流动相半硬质凝胶：适用于非水溶剂为流动相，而耐高压。硬质凝胶：适用于水或非水为流动相，高流速下操作。,空间排阻色谱法原理,类似于分子筛的作用，但孔径比分子筛大得多，为纳米数量级。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。太大分子不能进入，直接通过柱子并首先在色谱图上出现；小分子可进入胶孔渗透到颗粒中，在色谱图上后出现。溶剂分子最小，在色谱图上最后出现。适于分离分子质量较大的化合物（100105）,五、液相色谱法流动相,液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。极性组分k大。若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱法，非极性柱也称为反相柱。极性组分k小。,选择流动相的溶剂时应注意的几个因素：,（1）流动相的纯度：试剂不纯导致检测器噪声增加，同时也影响收集的馏分纯度。（2）避免使用会引起柱效损失或保留值变化的溶剂。氧化铝吸附剂不能使用酸性溶剂。在液液色谱中流动相与固定相不互溶，否则造成固定相损失，使柱子的保留特性变化。（3）试样要有适宜的溶解度，否则柱头易产生部分沉淀。（4）溶剂的粘度小些为好，否则会引起柱效下降。（5）应与检测器匹配。,流动相的极性,常用溶剂的极性顺序如下：水、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、二氧六烷、四氢呋喃、甲乙酮、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、异丙醚、二氯甲烷、氯仿、溴乙烷、苯、氯丙烷、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、环己烷、己烷、庚烷、煤油（极性最小）。,流动相的选择,在正相LLC中，可选用中等极性的流动相，若组分的保留时间太短，表示溶剂的极性太大，改用极性较弱的溶剂；若组分的保留时间太长，则再选用极性在上述两种溶剂之间的溶剂。为获得合适的溶剂强度（极性），常采用二元或多元组合的溶剂系统作为流动相。,正相色谱与反相色谱,离子交换色谱法、离子色谱法与离子对色谱法,共同点：能形成离子的物质离子交换色谱法基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同亲和力将其分离。离子交换色谱法主要用来分离离子或可离解化合物。可用于无机离子和有机物的分离。,离子交换原理，但采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；通常采用电导检测器，可准确、快速分离分析微量无机阴离子，现在延伸到金属阳离子和有机阳离子。有化学抑制型离子色谱法及非抑制型离子色谱法。,离子色谱法,离子色谱应用,离子对色谱法,离子对色谱法是将一种或多种与溶质分子电荷相反的离子加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。解决了以往难分离混合物的分离问题。适于强极性有机酸碱的分析。,分离类型的选择,根据分子量选择：相对分子量小于200，挥发性好适于气相色谱；分子量大于2000的适于空间排阻色谱；2002000适于标准液相色谱类型。根据溶解度选择：若可溶于水并能离解，采用离子交换色谱；若可溶于烃类，采用液-固吸附色谱法；若样品溶于四氯化碳，采用常规分配和吸附色谱法分离根据分子结构选择：离子型或可离子化的物质用离子交换；异构体用液固色谱；不同官能团的化合物、同系物用液液色谱；高分子用空间排阻。,第三节高效液相色谱仪,仪器结构,主要部件,(1)高压输液泵压力：150350105Pa。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。恒流泵示意图。,(2)梯度淋洗装置,内梯度（高压梯度）:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。外梯度（低压梯度）:用一台高压泵,通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂在常温常压下按一定的比例混合，用高压泵压入色谱柱。,梯度淋洗与程序升温,梯度淋洗的实质是通过不断改变流动相的强度，来调整混合样品中个组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。流动相强度包括溶质的极性、pH值和离子强度等。它所起的作用与气相色谱中的程序升温相仿，只不过是程序升温改变的是温度。,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样，用微量注射器加液体宜用“停流进样”。其结构如图所示：,(4)高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16mm，柱长540cm。减小填料粒度和柱径以提高柱效。装柱方法有干法（粒径大于20um）和湿法两种,(5)液相色谱检测器,紫外检测器(双光路),紫外检测器特点,组分浓度与吸光度关系遵循朗比定律；应用最广:对大部分有机化合物有响应；灵敏度高:最低检测浓度可达10-9gmL；可用于梯度洗脱：对温度和流速不敏感；光电二极管阵列检测器是紫外可见光度检测器的一个重要进展。,荧光检测器（fluorescencedetector）,直角型滤色片荧光检测器示意图,荧光检测器特点,对具有对称共轭结构的多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。不发射荧光的物质可通过化学衍射转变。灵敏度比紫外光度检测器高2个数量级，线性范围仅为103。,示差折光检测器,示差折光检测器特点,通用型检测器：几乎每种物质都有不同的折射率灵敏度：可达10-7gmL对温度变化敏感，不适于梯度淋洗,电导检测器,作用原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。检测器响应受温度影响很大，一般用热敏电阻器监测。离子色谱法中广泛应用。,蒸发光散射检测器,通用型检测器测量原理：不挥发性溶质对光产生散射现象，散射光产生电信号，电信号强弱取决于溶质颗粒大小与数量单位时间内通过散射室溶质颗粒的数量、流动相性质、雾化气体以及流动相流速均为影响因素比示差折光显示器灵敏度高用于检测糖类、表面活性剂、聚合物、脂类等无紫外活性的物质。,HPLC应用,适用范围：高沸点、热稳定性差、生理活性以及相对分子量比较大的物质。如核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、除莠剂等。在化工、环保、临床药物等领域广泛应用，目前在生命科学中显示突