核酸化学课件

第二章核酸的结构与功能,核酸的概念及重要性核酸的基本组成DNA的结构与功能RNA的种类、结构与功能核酸的性质核酸的序列测定人类基因组计划简介,StructureandFunctionofNucleicAcid,一、核酸的概念及重要性,1、研究历史1869Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一种含磷酸的有机物，当时称为核素（nuclein）后称为核酸（nucleicacid）1944Avery等通过肺炎球菌转化试验证明DNA是遗传物质1953Watson和Crick提出DNA结构的双螺旋模型1958Crick提出遗传信息传递的中心法则70年代建立DNA重组技术1990年美国启动人类基因组计划(HGP)1994年中国人类基因组计划启动2001年美、英等国完成人类基因组计划基本框架,Avery的肺炎球菌转化实验,噬菌体侵染实验,2、核酸的概念核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息3、核酸的分类脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）,二、核酸的组成,核酸的元素组成C、H、O、N、P（910%）,核酸的分子组成核苷酸碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖磷酸(phosphate),（一）戊糖,核糖和脱氧核糖均为-D-型呋喃糖通常糖环的四个原子处于同一平面，另一个原子偏离平面，若突出的原子偏向C-5一侧，称内式（endo），若偏向另一侧，称为外式（exo）。DNA中的核糖通常为C-3内式或C-2内式,1、嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),（二）碱基,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,腺嘌呤adenine,（A）,鸟嘌呤guanine,（G）,（二）碱基,1、嘌呤(purine),2、嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),嘧啶,1,2,3,4,5,6,H,胞嘧啶Cytosine,（C）,尿嘧啶uracil,（U）,H,H,胸腺嘧啶thymine,（T）,2、嘧啶(pyrimidine),嘌呤,嘧啶,Adenine(A),Guanine(G),Uracil(U),Cytosine(C),Thymine(T),2.核苷的种类核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR,（三）核苷(ribonucleoside),由嘌呤,由嘌呤形成的核苷可以有顺式和反式两种结构类型嘧啶形成的核苷只有反式构象是稳定的。A型和B型DNA中的糖苷键均为反式。,腺嘌呤,腺苷,尿苷,OH,假尿苷（）,2.核苷酸的种类核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,（四）核苷酸(ribonucleotide),3.体内重要的游离核苷酸及其衍生物,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,环化核苷酸:cAMP，cGMP,AMP,ADP,ATP,cAMP,4.核苷酸的功能,各种（脱氧）核苷三磷酸是体内合成DNA、RNA的直接原料。ATP是生物体能量代谢中通用的能量载体。有些核苷酸还参与特定的代谢过程，如UTP参与多糖的合成；CTP参与磷脂的合成；GTP参与蛋白质和嘌呤的合成等。核苷酸参与一些辅酶的组成。如NAD+、FAD等。环化核苷酸往往是细胞功能的调节分子和信号分子。如cAMP参与代谢的调节和基因表达的调控等。如ppGpp参与调节原核细胞蛋白质的合成。,含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD等都含有AMP,5、核苷酸的性质,核苷酸的碱基具有共轭双键结构，在260nm左右有强烈吸收峰。核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电解质，在一定pH条件下可形成兼性离子，该pH即为该核苷酸的等电点。尿苷酸的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子。磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性。磷酸基的两个解离常数分别为pK1/=0.71.6pK2/=5.96.5,应用pH3.5时，所有的核苷酸都带净负电荷，电泳时会以不同的速度向正极移动。移动的速度顺序是UMPGMPAMPCMP用阳离子交换树脂分离四种核苷酸时，低pH（如1.0）下都带上净正电荷（UMP除外），结合在树脂上后，提高盐浓度洗脱，UMP首先被洗脱下来，接着是GMP，最后是CMP和AMP。即洗脱顺序是UMPGMPCMPAMP,（四）.核苷酸的连接方式,核苷酸之间以3,5-磷酸二酯键连接形成没有分支的多核苷酸链，即核酸。,C,G,A,书写方法,5pApCpTpGpCpT-OH3,5ACTGCT3,三、DNA的结构与功能,DNA分子中各脱氧核苷酸的排列顺序叫做DNA的一级结构，简称为碱基序列。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息。一级结构的表示法结构式，线条式，字母式一级结构测定,StructureandFunctionofDNA,（一）DNA的一级结构,DNA一级结构,DNA一级结构的表示法,DNA酶法序列分析的原理,酶反应,电泳方向,5,3,引物,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddCTP,ACGT,（二）DNA的二级结构双螺旋,Descriptionofthe3-DstructureofDNA,FrancisCrick碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。,A与T,C与G,例题1、某细菌DNA双链相对分子质量为4.0108。求此DNA分子的长度，此DNA分子的体积。例题2、写出下列DNA序列的互补序列：GCTTAGTA例题3、在中性pH条件下，ApGpUpC携带多少电荷？,氢键碱基堆积力（basestackingforce）磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和,3、DNA的双螺旋结构稳定因素,4、DNA双螺旋构象的类型,B-DNA和Z-DNA的转换,DNA双螺旋的不同构象,H-DNA,是一种三股螺旋DNA。在酸性条件下更容易形成,因为这种结构在形成分子内三股螺旋时胞嘧啶需发生H+化过程,故称为H-DNA。三股螺旋中,一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合。第三股的碱基可与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对。即第三个碱基以A或T与A=T中的A配对；G或C与GC中的G配对，C必须质子化，与G配对只形成两个氢键,（Hoogsteen配对）,DNA分子间的三链结构,(三)DNA的三级结构,松弛型DNA双链环形DNA解链环形DNA超螺旋DNA(superhelixDNA)线形DNA真核生物细胞核内DNA的包装过程,1、双链环形DNA超螺旋的形成,2、真核生物细胞核内DNA的包装过程染色体的组装,真核生物染色体是由DNA和蛋白质组成。染色体的基本结构单位是核小体(nucleosome)染色体中与DNA紧密结合的蛋白质叫做组蛋白（histone）由核小体开始，DNA被包装成一系列高级结构，最后形成在显微镜下看到的致密的染色体。没有单一的模型合理描述这些结构，但原理：真核染色体中DNA的压缩就是盘绕盘绕再盘绕。,核小体,核小体是由组蛋白核心和盘绕其上的DNA所构成。核心由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子组成，是一个八聚体。DNA以左手螺旋在组蛋白核心上盘绕1.8圈，共146bp核小体之间连接DNA的长度随不同核小体略有不同。平均每个核小体重复单位约占200bp。组蛋白H1结合于连接DNA上。DNA组装成核小体，其长度缩短7倍,核小体盘绕和染色质示意图,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA（2nm）,核小体链（11nm，每个核小体200bp）,纤丝（30nm，每圈6个核小体）,突环（150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（300nm，6个突环）,螺旋圈（700nm，每圈30个玫瑰花）,染色体（1400nm，每个染色体含10个玫瑰花200bp）,（四）DNA与基因组,1、基本概念基因(gene)：含合成生物功能产物（无论是蛋白质还是RNA）必需信息的DNA分子片段。为蛋白质或RNA编码的基因称为结构基因（structuralgene）。只有调节功能，而并不转录生成RNA的DNA片段称调控序列（regulatorysequence）。一个细胞的所有基因和基因间的DNA组成了细胞的基因组（genome）。,2、病毒和细菌基因组的特点（1）病毒和细菌基因组的共同点基因组较小，通常只有一个环形或线形的DNA分子。基因组的大部分序列用来编码蛋白质。功能相关的基因常串联在一起，形成转录单元-操纵子。（2）病毒基因组的特点每种病毒只含有一种核酸。不少病毒是RNA病毒。有重叠基因,正链病毒、负链病毒、双链病毒、逆转录病毒,SARS病毒：单链（+）RNA,（3）细菌基因组的特点通常有一个环形或线形DNA分子，只有一个复制起始点。不少细菌还含有若干质粒。编码蛋白质的基因多为单拷贝的。基因组中有多种调控区和少量重复序列。基因组中存在与真核生物类似的可移动DNA序列-转座子,3、真核生物基因组的特点,高度重复序列一般富含A-T或G-C，富含A-T的在密度梯度离心时在离心管中形成的区带比主体DNA更靠近管口；富含G-C的更靠管底，称为卫星DNA（satelliteDNA）,（1）基因组较大（2）不存在操纵子结构（3）存在大量的重复序列高度重复序列中度重复序列低度重复序列单一序列（4）有断裂基因,串联重复序列主要包括小卫星序列、微卫星序列和rDNA等；散布重复序列主要包括短散布元件、长散布元件和转座子。,乳糖操纵子(lacoperon)的结构,断裂基因：由于基因中内含子的存在。,mRNA,1872bp,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。,例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferongene)没有内含子。,四、RNA的结构与功能StructureandFunctionofRNA,RNA分子中核苷酸的排列顺序叫做RNA的一级结构。大多数天然RNA是一条单链组成，不能形成双螺旋的二级结构。可以形成部分双螺旋结构。所以RNA分子是含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链。常见的配对方式是G与C，A与U。但G与U配对也相当普遍。配对的双链是反向平行的。单链RNA采取右手螺旋构象。,RNA的种类、分布、功能,1、tRNA的结构特点：沉降系数在4S左右，由7090个核苷酸组成。含有大量的稀有碱基，约1020%。如D、I等。3末端为CCA-OH。5末端大多数为G，也有C的。具有三叶草形的二级结构（四环四臂的二级结构）。具有倒“L”形的三级结构。,（一）RNA的结构与功能,2、tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,二氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,*tRNA的二级结构三叶草形氨基酸臂DHU环反密码环额外环TC环,氨基酸臂,额外环,*tRNA的三级结构倒L形,TC臂,D臂,（二）信使RNA的结构与功能,内含子(intron),1、mRNA成熟过程,外显子(exon),2、mRNA结构特点,1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,3.游离的mRNA可以产生高级结构，但在翻译时必需解开。,帽子结构,3、mRNA的功能把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,1、rRNA的结构特点单链，螺旋化程度较tRNA低。形成多环多臂的二级结构。,（三）、核糖体RNA的结构与功能,2、rRNA的种类真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA,原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA,16SrRNA的结构,核糖体的组成,3、rRNA的功能,参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。1992年，H.F.Noller等证明大肠杆菌23SrRNA能够催化肽键的形成。证明核糖体是一种核酶。,（四）、其他小分子RNA及RNA组学,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。,1、snmRNAs的种类核内小RNA（smallnuclearRNA，snRNA）核仁小RNA（smallnucleolarRNA，snoRNA）胞质小RNA（smallcytoplasmicRNA，scRNA）催化性小RNA（smallcatalyticRNA）小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）,RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,2、RNA组学,3、核酶（ribozyme）具有催化功能的小RNA。催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA,RNA和相关前体可能是最早的基因和催化剂,在现代的生命体中，核酸编码了体现酶结构的遗传信息，酶也能催化核酸的复制和修复，这两种生物分子的相互依赖提出了另人困惑的问题：谁最先出现？DNA还是蛋白质？回答可能：都不是。RNA分子在自身形成过程中可作为催化剂，这一发现表明RNA和相关前体可能是最早的基因和催化剂。,思考题：有人认为RNA是最早出现的生物大分子，你能对此提出何种支持或反对的理由，并试对上述说法进行评价。（2000，中国海洋大学）,一种可能的“RNA世界”的假想,生命起源以前的“汤”的产生，包括核苷酸，是来源于地球原始大气层的组分。,具有随机序列的短小RNA分子的产生,具有自我复制的催化性的RNA碎片的选择性复制,特异性肽的合成，由RNA催化,肽在RNA复制中扮演越来越重要的角色；RNA与Pr共同进化,出现原始的翻译系统，具有RNA基因组和RNA-蛋白质催化剂,基因组RNA开始拷贝成DNA,DNA基因组开始在蛋白质催化下在RNA-蛋白质复合体（核糖体）上进行翻译,五、核酸的性质TheCharactersofNucleicAcid,（一）、一般理化性质形态溶解性溶液黏度DNA白色纤维微溶于水，不溶高RNA白色粉末于一般有机溶剂低稀碱液中的稳定性颜色反应DNA稳定脱氧核糖+酸+二苯胺蓝紫色化合物RNA被水解核糖+浓盐酸+苔黑酚绿色化合物,（二）、核酸的紫外吸收性质,嘌呤和嘧啶环的共轭体系强烈吸收260290nm波段紫外光，其最高吸收峰接近260nm。核酸的光吸收值比各核苷酸成分的光吸收值之和少30%40%RNA的紫外吸收光谱与DNA的差别不大。,1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,OD260的应用,（三）、DNA的变性(denaturation),1、定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,DNA的变性过程,加热,部分双螺旋解开无规则线团链内碱基配对,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应(hyperchromiceffect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。减色效应(hypochromiceffect)：？,2、热变性和Tm：熔解温度(meltingtemperature),(1)DNA的热变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度，用Tm表示。,1,2,3,（2）影响Tm大小的因素:,DNA分子中（G+C）的百分含量：测定Tm值可推算核酸碱基组成。经验公式为：（G+C）%=（Tm69.3）2.44介质中的离子强度。DNA的均一性。,（四）、DNA的复性与分子杂交,1、DNA复性(renaturation)在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,DNA复性时，其溶液OD260降低。这种现象叫做减色效应（hypochromiceffect）,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,复性的速度与一系列因素有关。,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,2、分子杂交(hybridization),（1）定义,（2）核酸分子杂交的应用制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例：southern印迹法研究DNA分子中某一种基因的位置定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,七、核酸的序列测定Sanger提出的酶法,酶法（又称链终止法）的技术基础：灵敏的凝胶电泳技术。合适的聚合反应体系：模板、引物、dNTP、聚合酶等一定比例的2,3-双脱氧核苷三磷酸,酶法序列分析的原理,酶反应,电泳方向,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddCTP,ACGT,DNA的Sanger测序法(酶法),dNTP,反应混合物,未知序列的单链DNA,CTGACTTCGACAAAGAA,5,3,焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术,Pyrosequencing是1987年Nyren等发展起来的一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。其基本原理如下：,第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA聚合酶-DNAPolymerase、ATP硫酸化酶-ATPSulfurylase、荧光素酶-Luciferase和三磷酸腺苷双磷酸酶-Apyrase）和底物混合物（包括腺苷-5-磷酰硫酸，即APS和荧光素-Luciferin,第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3末端，同时释放出一个的焦磷酸（PPi）。,第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。,第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。,第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。,