Gene-Expression---Relative-Quantification-2

GeneExpressionRelativeQuantification:DataManagement,ReferenceGenes-Plant植物,实验结果标明，很多常用内参基因的表达是随环境变化的，并且在根和叶片中可能不同呢。A,常用内参基因相对表达,i.e.ACT2(At3g18780,black),TUB6(At5g12250,red),EF-1a(At5g60390,green),UBQ10(At4g05320,cyan),andGAPDH(At1g13440,blue).B,新的内参基因相对表达,i.e.At4g34270(black),At1g13320(red),At1g59830(green),At4g33380(cyan),andAt2g28390(blue).,Genome-WideIdentificationandTestingofSuperiorReferenceGenesforTranscriptNormalizationinArabidopsis,PlantPhysiology,September2005,Vol.139,pp.517,GAPDH：GAPDHmRNA在不同癌组织(包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等)中的表达升高；在不同个体间、怀孕期间以及细胞周期的不同阶段等变化很大-actin：当细胞向恶性转化时,-actinmRNA的表达水平增加而假基因的的存在也可干扰-actin的检测。18SrRNA和28SrRNA:rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响。在有丝分裂期间,28S、18SrRNA明显减少或停止表达。在各种因素下，例如实验条件下细胞周期的不同阶段,看家基因mRNA的表达水平是变化的。,ReferenceGenes-细胞或组织,Accuratenormalizationofreal-timequantitativeRT-PCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes:GenomeBiology2002,3(7):research0034.10034.11,ReferenceGeneValidation-验证,均一化处理样本量RNA浓度细胞数组织质量CDNA浓度referencegenesCT值保持一致,ActinRef.Gene,IL1-bTargetGene,Allcellsplatedsametimefromsamesuspension,ReferenceGeneValidation-验证,ReferenceGeneValidation-验证,ActinRef.Gene,IL1-bTargetGene,HousekeepingGenes-内参基因,(Vandesompeleetal.,2002),引物库,RelativeQuantification-相对定量,相对值(CT)不用内参基因均一化处理以质量单位做为标准准确量化初始材料均一化表达(CT)考虑初始样本差异以内参基因做为标准一个或多个在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因,简单,复杂,RelativeQuantification-均一化表达,CT假设100%efficiency一个内参基因Pfaffl法扩增效率一个内参基因Vandesompele法扩增效率多个内参基因均一化,GOI,Tissue#2:,Tissue#1:,22,24,DeltaCt:,24-22=2,RelativeQuantification-Ct,Reference,GOI,21,Tissue#2:,Tissue#1:,20,22,24,RelativeQuantification-(2-Ct),RelativeQuantification-扩增效率,Ct,Startingquantity,90%,24,22,ProblemwiththeCT,Ct,90%,24,22,100%,Startingquantity,ProblemwiththeCTSlopesarenotparallel,RelativeQuantification-扩增效率,EfficiencytargetdeltaCttarget(control-sample),Foldinduction=,EfficiencyreferencedeltaCtreference(control-sample),Efficiency=10-1/slope,(Pfaffl,2001;NucleicAcidResearch),EfficiencytargetdeltaCttarget(control-sample),Foldinduction=,EfficiencyreferencedeltaCtreference(control-sample),相对定量-Pfaffl法,Primerset#1Reference,Primerset#2GOI,21,Tissue#2:,Tissue#1:,20,22,24,90%=1.9,DeltaCt:,Efficiency:,20-21=-1,100%=2,24-22=2,2targetdeltaCttarget(24-22=2),Foldinduction=,1.9referencedeltaCtreference(20-21=-1),=,4,0.53,=,7.5,0.53,7.5,(FromStandardcurve),相对定量-Pfaffl法,方法比较,DCtmethod:(noreferencegene)Foldinduction:4DDCtmethod:(referencegene)Foldinduction:8Pfafflmodification:(referencegeneandefficiency)Foldinduction:7.5,多内参基因,单个内参基因校正可能会产生误差25%可能性高至3.0倍差异10%可能性高至6.4倍个别的样本差异表达相差20倍利用多个内参基因校正http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/IQ5/CFX96的软件可以计算,Differentreferencegenes,MultiplexRT-qPCRResults,geNorm,Sof